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1、精子中组蛋白甲基化调控的紊乱将通过隔代遗传给子代造成损伤Keith Siklenka, Serap Erkek, Maren Godmann, Romain Lambrot, Serge McGraw,Christine Lafleur, Tamara Cohen, Jianguo Xia, Matthew Suderman, Michael Hallett,Jacquetta Trasler, Antoine H. F. M. Peters,* Sarah Kimmins*前言：尽管，父本也为胚胎贡献一半的遗传信息，但胚胎的起始健康状态的关注点在母本。父本效应被认为与一些癌症，糖尿病，肥胖等
2、复杂的疾病相关。这些疾病发病率皆上升，而仅靠基因不能解释这种现象，这启示通过非基因遗传的表观遗传可能对于疾病的传染具有重要作用。表观遗传体系包括DNA甲基化修饰，组蛋白转录后修饰，非编码RNA。基于人类和动物的研究表明，表观遗传可能在环境诱导的表观特征在子代的遗传中具有重要作用。这些表观特征在第一，二子代中，与改变基因的表达和组织的功能相关联，分别称为代间和隔代遗传。基于此类的父本表观遗传的的机制并不清楚。基本原理：精子的发生包括细胞快速分裂，特定的转录程序，产生具有高度凝聚染色体的泳动细胞。与精子核高度一致，极少的组蛋白的滞留暗示它对发育的作用。尽管是表观遗传的重点，但DNA 甲基化在父本的
3、表观遗传中的作用依旧不清楚。只要在精子的CpG富集的区域所发生的微小的DNA甲基化修饰改变已证明与环境诱导的表观特征的遗传有关。取而代之的是，在涉及精子中组蛋白或RNA状态的改变的父本表观遗传中，这可能存在一种联合作用的分子机制。精子中组蛋白的功能和修饰在胚胎发育，子代健康和表观遗传是不清楚的。通过在小鼠精子发生期过表达人类去除KDM1A组蛋白的第四个氨基酸的甲基化的去甲基化酶，我们培育出了精子发育相关基因中CpG 岛H3K4me2减少的小鼠模型，我们研究了其子代的发育和健康状态。结果：雄性的转基因子代小鼠与C57BL/6品系的雌鼠杂交，培育出实验用的杂合转基因(TG)和非基因改造的(nonT
4、G)的子代。每代中(TG)和(nonTG)分别与57BL/6品系的雌鼠杂交，并研究其子代的代间遗传和隔代遗传效应。我们发现在一代中KDM1A的过表达严重损伤了其发育和其子代的存活。在缺少KDM1A表达的种系中，这中缺陷一直遗传了两代。我们检测了转基因(TG)和非基因改造的(nonTG)的子代的组蛋白和DNA甲基化状态。KDM1A的过表达导致了超过2300 个基因的H3K4me2的缺失，其中包含了许多发育相关的基因。不同于其他父本的转基因遗传案例，我们没有在精子中看到CpG 富集区域的的DNA甲基化的改变。相反，在转基因(TG)和非基因改造的(nonTG)的后代，它们子代及其二细胞期，我们检测到
5、它们的RNA量发生显著而相似的变化。在子代中这些表达水平的改变和所观察到的异常表型与在精子中组蛋白的甲基化水平的改变相关联。这些研究证明，在精子发生期KDM1A对子代有主要启发性的作用，并参与组蛋白的甲基化，精子RNA作为一个潜在的转基因遗传的中介。我们的数据强调转基因表观遗传的的复杂性，这可能涉及多种分子，包括在精子发生期不同染色体状态的形成和精子形成RNA。结论：精子发生期准确的组蛋白甲基化对于跨世代的子代发育和存活具有重要作用。这些发现证明，组蛋白的甲基化可为解释父本的表观遗传的潜在分子机制。由环境诱导的组蛋白的修饰可能改变胚胎的发育进程，导致复杂疾病的时代遗传。一个必须的步骤就是建立功
6、能和环境压力的联系，精子表观遗传学组的图谱，子代中基因表达改变的影响和代谢过程。基于到越来越多的证据，我们很快将得出一个合理结论：未来的父亲保护器他们精子的表观基因组父亲的一生的经历可以传给其子代而影响其发育。但是，这种基于表观遗传的传递机制并不清楚。不像体细胞，在精子中几乎没有核小体，且其表观遗传的功能并不清楚。我们培育出一种过表达H3K4的去甲基化酶KDM1A（也叫LSD1）的小鼠，这种酶在精子发生期可以减少产生的精子中H3K4的二甲基化。过表达的KDM1A一代会出现子代的发育和存活严重受损。这中缺陷会持续的出现在KDM1A缺陷的品系中，且在精子和子代中，伴随相关的RNA谱系的改变。我们研
7、究表示在发育的精子中，组蛋白的去甲基化可激活异常发育的表观遗传，而没有CpG富集区DNA甲基化的改变。在人类婴儿中有3%出生时伴有缺陷，这种缺陷可以由遗传因子或环境压力引起，尽管这其中有50%是先天引起的。尽管父亲也给子代贡献了一半的遗传物质及可能的一些表观遗传信息，但这方面的预防工作的重点却在母亲。基于人类和动物学实验表明表观遗传机制可能在由环境诱导的表观特征的遗传中起作用(38)。这种表观特征已与子一代 、二代或三代的基因表达和组织功能的改变相关(38)。基于世代数和父源，这种现象与代间和隔代表观遗传(Fig.1)。母本和父本的这类效应的遗传与生殖细胞的DNA甲基化改变有关(7, 911)
8、。在精子中，在基因启动子DNA的甲基化并不普遍，但是重复元件多被甲基化(1315)。尽管DNA的甲基化修饰研究是表观遗传研究的重点，但在父本的表观遗传中，它的重要性并不清楚。绝大多数研究报道，在精子中CpG富集区只要较少的发生DNA甲基化，CpG富集区通常认为与环境诱导的表观特征的遗传相关联(5, 7, 8, 10, 11)。父本的世代表观遗传也许与组蛋白的状态、RNA或精子中其他成分的改变相关。在精子形成的最后阶段，染色质经历了大规模的重塑，精子中特异的鱼精蛋白取代大部分的组蛋白，这对精子核产生了广泛的影响(20)。尽管如此，只要小部分的组蛋白（小鼠中约1%，人中约15%）保留在成熟的精子中
9、。最近几项研究鉴定了小鼠和人的精子核小体在整个基因组的分布，但结果有部分不统一，这同Saitouan 和Kurimoto的综述中表述相一致 (22)。利用一种有效的方法打开高度凝集的小鼠精子核，接着用微球菌核酸酶消化和深度测序，我们观察到接近10倍比例的序列定位于与核小体关联的DNA上CpG富集的启动子序列。在小鼠精子中组蛋白的保留是可预测的，主要发生于高CpG密度区和地DNA甲基化密度区，比如看家基因和发育调控基因。在未甲基化的CGIs区的保留在小鼠和人中是保守的。在精子中，看家基因的启动子中保留组蛋白变体H3.3，被H3K4二和三甲基化标记。相对的，精子中发育调控基因的启动子包含H3.3和
10、经典的H3.1/H3.2，被H3K27标记。在胚胎发育，子代健康和表观遗传中，精子中组蛋白的功能和发生的修饰大部分并不了解。在Caenorhabditis elegans中，H3K4me2去甲基化酶的缺失与代间的表型有关，H3K4me2在原生殖细胞的稳定积累有效促使不孕。鼠源中赖氨酸的去甲基化酶Kdm1a，通过催化主要的单和二甲基化的H3K4的去除来调控基因的表达及发育。为研究在精子中滞留组蛋白对于胚胎发育和代间的表观遗传的作用，我们靶向H3K4的甲基化，它是与精子中发育基因相关的表观标记。我们致力于培育出这样的小鼠模型，它可产生参与发育基因的CGIs 区的H3K4me2减少的精子。为达到这个
11、目标，我们在小鼠的精子的发生期过表达了人KDM1A H3K4去甲基化酶，并研究了子代的发育和适应性。由杂合子转基因的父代产生的父代和非转基因的子代中出生的缺陷率，婴儿死亡率及基因表达改变率都上升。我们鉴定了转基因和转基因雄性子代的精子组蛋白和DNA甲基化状态。过表达KDM1A基因与超过2300个基因的H3K4me2 特异丢失有关，包括一些发育调控基因。不同于其他父系的代间遗传案例，我们没有观察到精子的CpG富集区的DNA甲基化的改变。相反，我们检测到在转基因和非转基因子代精子中的RNA转录物存在稳定相似的改变，在子代的二细胞期也有同样发现。在子代中所观察到的表达水平的改变和表型异常与精子中组蛋
12、白甲基化水平的改变相关联。该研究证明精子中KDM1A活性和相关组蛋白甲基化的减少会给子代带来灾难性的后果。另外，我们研究表明组蛋白的甲基化和精子RNA为代间遗传的潜在中介分子。结果转染到雄性小鼠生殖细胞系中的KDM1A基因特异性地过表达我们培育了两种转基因的小鼠细胞系，即在生殖腺特异表达、截短的人源多聚肽链延伸因子的启动子调控下，特异表达人KDM1A H4K去甲基化酶。这个启动子在睾丸生殖细胞中很活跃但在其他组织就不活跃。转入的KDM1A的mRNA出现于精原细胞和精母细胞中，在精子附近的转录水平低。同时观察到转基因标记绿色荧光蛋白也有相似的分布。两种品系的子代的睾丸组织病理学评定揭示，在，从第
13、一期精子发生期到成年的所有年龄段精子的发生皆正常。同样地，基本未影响睾丸和附睾重量及精子数。为了评估DNA的完整性，我们模拟了gH2AX的磷酸化，利用末端脱氧核苷酰转移酶介导的脱氧尿苷的三磷酸化缺口末端标记(TUNEL) 来测定DNA的损害。在转基因和对照动物的精原细胞、静母细胞和精子细胞中，磷酸化的H2AX在细胞内的分布是不同的。但我们并没有在转基因雄鼠检测到TUNEL阳性细胞数的增加。最后，在转基因、非转基因和对照组中LINE-1逆转录转坐子的表达并无差异。总而言之，这些数据表明KDM1A的表达不诱导DNA损伤或基因组的不稳定性。在转基因和非转基因雄性产生的子代中代间遗传的父本效应我们繁育
14、了TG和非TG的雄性，检测在过表达KDM1A健康子代中可能存在的代间和隔代遗传的父本效应。家系和世代图如Fig. 2.所示。雄性的转基因子代与C57BL/6磁性鼠杂交，培育出杂合子TG和非TG的子群。从TG二代到底四代和非TG3代到第五代的雄鼠皆与C57BL/6雌鼠杂交，子代用于研究代间和隔代遗传效应。首先，我们分析了多代TG和非TG的雄性幼崽的发育和存活情况，我们我们检测了出生一窝的数量、重量和性别，并检测了幼崽出生36和48h及出生后6和21天的小鼠。与对照组C57BL/6相比，由TG2-4和非TG3代中雄性产生的子代的婴儿存活率下降了。我们观测到转基因表达对存活力的积累效应：由于连续世代
15、的精子都处于转基因的压力下，在两种品系中转基因子代的存活率皆下降。我们也观察到幼崽中四肢、骨骼和皮肤异常和发育不全者。单个雄性所产生的子代分析表明，上述所产生的现象并不是由少数雄性父本传给子代的异常造成，而是由许多雄性父本将表观遗传的改变传给了不同的子代。而且，子代婴儿的存活和异常率与子代是否从转基因父本获得的转基因无关联。在单倍体的精子的表观基因组中可能发生的频率并不携带真正的转基因，这可能是由于在TG杂合子雄性中，KDM1A在精子发生期不同阶段的生殖细胞中表达活跃，如在二倍体的精原细胞精母细胞。而且，即便在两次减数分裂之后，由于不完全的有丝分裂和减数分裂，单倍体的精子通过细胞间的连接分享m
16、RNAs。结果，尽管只有50%的精子中的转入基因发生转录，但所有的单倍体精子在细胞多核期皆受到了影响。由于转基因的表达限定于发育的生殖系中，非TG雄性子代在发育的精子中并不表达转入的基因，这些数据表明在非TG幼崽中观察到的遗传表型与世代的表观遗传现象有关。C57BL/6母本可能踢出一些它们认为异常的幼崽，我们也许低测了被测幼崽中表型异常率。为了解决这种可能性和进一步鉴定在世代中的发育缺陷，我们对底18.5天的胚胎进行了详细的表型发育分析。每代的转基因TG2-4(F0to F2)和TG3-5(F1to F3)雄性与至少两只磁性交配，用测定的窝崽数、植入前后的损失及异常的幼崽来评估怀孕数。TG产生的子代中，异常者各不相同，且被多个系统影响。发育错误案例有骨骼异常,其包括前后指畸形、脊柱缺陷、露骨结构异常、四肢和体节发育失败。同样，在由非TG3和非TG4产生的子代群中，F2和 F3子代中，与对照组对比，我们观察到明显更高频率可见异常和骨骼缺陷。在F3子代（由非TG父系产生）中的异常者代表代间遗
