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1、2019年1月18日星期五,SWAU,生物化学实验原理与方法,2019年1月18日星期五,SWAU,第一章：生物化学物质的制备 第二章：离心技术 第三章：层析技术 第四章：电泳技术 第五章：基因克隆技术 第六章：PCR技术 第七章：生物芯片技术,2019年1月18日星期五,SWAU,第一章:生化物质的制备,生化物质通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物。这些大分子物质在生物体内具有各种生理活性，这些活性的产生与其结构有着密切关系，因此，分离此类物质不能用一般的化学分离方法，而是采用比较特殊的方法。这些方法与一般的化学分离方法相比，有下列几个特点： 1、
2、生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢变化，如蛋白质和核酸的水解。 2、有些化合物的含量极微，如激素等。 3、许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。 4、生化分离制备几乎都在溶液中进行，影响因素很多，实验方法经验性较强。,2019年1月18日星期五,SWAU,第一节：生物材料的选择,选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好；来源丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价值等。 生物材料一般可以分为两大类：天然生物材料和人工生物材料。 天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的
3、生物个体、器官或组织。 人工生物材料又分为三种： 1、 新品种材料 2、组织培养材料 3、生物产品与生物制品材料,2019年1月18日星期五,SWAU,第二 节：细胞及组织的破碎,细胞及组织破碎的方法多种多样，根据实验目的和材料的不同可以采用不同的 细胞破碎方法，细胞破碎方法大致可以分为四类： 机械破碎： 研磨法；组织捣碎法；超声波法；压榨法；冻融法 溶胀和自溶 溶胀：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象。 自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用，发生溶解的现象。 化学处理 用脂溶性的溶剂（如
4、丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可以把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类物质，并导致整个细胞破碎。 生物酶降解 生物酶有降解细菌细胞壁的功能，在用此法处理细胞时，先是细胞壁降解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。,2019年1月18日星期五,SWAU,第三节：生物分子的提取,提取是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等。 生物分子可以分为生物大分子和生
5、物小分子。生物小分子的结构由较强的共价键决定；生物大分子中除共价键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。因此，这两类生物分子的提取液成分和操作条件差别很大。 1、生物小分子的提取 2、生物大分子的提取 蛋白质和酶的提取 核酸的提取,2019年1月18日星期五,SWAU,溶剂提取法,原理:利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来 影响溶剂提取效率的因素（影响溶解度的的因素） 1、溶剂的性质：（根据相似相溶原理） 2、离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度对不同物质溶解度的影响不同，如高离子强度下DNA-核蛋白溶解度增加，而低离子强度
6、下RNA-核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，在稀盐溶液中溶解度增加（盐溶）。 3、PH值：溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，不能是阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。 4、温度：温度的升高可以增加物质的溶解度。 5、去垢剂：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如SDS，Tween20，Triton X-100。,2019年1月18日星期五,SWAU,2019年1月18日星期五,SWAU,第四节：生物大分子的浓缩,1、沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉
7、淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。 盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等 。 2、吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。 3、超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。 4、透析浓缩法 5、减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。 6、冰冻干燥法,2019年1月18日星期五,SWAU,一、硫酸氨盐析法,原理：根基蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增
8、高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出，。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。,2019年1月18日星期五,SWAU,2019年1月18日星期五,SWAU,影响蛋白质盐析的因素 、蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般为2.5%-3.0%的蛋白质浓度较适中。 、离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半
9、径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。 、对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。 、温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在操作。,2019年1月18日星期五,SWAU,二、有机溶剂沉淀法,原理：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。有机溶剂的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数从而 增强分子之间的相互作用，使其溶解度降低。对于具有表
10、面水层的生物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，使这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。 优点：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤比较容易。 缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子强度及离子种类对其也有影响。,2019年1月18日星期五,SWAU,2019年1月18日星期五,SWAU,三、透析浓缩法,原理：天然或人工半透膜只允许小分子通过而阻碍大分子通过。当膜的两侧存在小分子浓度梯度差时，小分子就从高浓度一侧向低浓度一侧扩散，直至达到平衡，如果能不断去
11、除扩散出来的小分子，从而达到分离纯化的目的。 影响透析的因素 1、半透膜的通透性：半透膜的通透性取决于膜孔径的大小，在能阻碍大分子扩散的前提下，孔径越大，透析速度越快。 2、透析外液的更换 3、温度：温度越高，透析速度越快。 4、压力：用跨膜的压力梯度可加速大分子的分离速度。 5、溶剂,2019年1月18日星期五,SWAU,2019年1月18日星期五,SWAU,四、等电点沉淀法,原理：利用两性电解质在等电点处溶解度最小的性质。不同的两性电解质其等电点不同，其在电中性时溶解度不相同。因而等电点沉淀法可用于某些两性电解质的分离如氨基酸、蛋白质、核苷酸等，为了增加沉淀效果，往往在等电点时再加上其他沉
12、淀因素，所以幻灯片 2等电点沉淀法一般不单独使用，常和盐析法、有机溶剂沉淀法一起使用，以提高其沉淀能力。,2019年1月18日星期五,SWAU,第二章：离心技术,第一节、离心技术的原理 当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴。在相同转速条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。经过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离。,2019年1月18日星期五
13、,SWAU,第二节、影响离心沉降速率的因素,球型颗粒在自然沉降过程中： 摩擦力F1=6rpdr/dt 浮力F2=(p-m )Vg V=4/3rP2 球形颗粒的自然沉降速率：dr/dt=2rp2 (p-m)g/9 在离心力作用下，非球形颗粒的沉降速率: dr/dt=2rp2(p-m)w2 r/9 (f/f0) 影响沉降速率的主要因素：颗粒半径rp的大小；颗粒形状；颗粒与悬浮的密度差(p-m ) ；一定温度下悬浮介质的黏度系数；离心加速度w2r。 在确定的条件下，沉降速率主要取决于离心机的转速。,2019年1月18日星期五,SWAU,第三节、沉降系数,dr/dt=2rp2(p-m)w2 r/9 (
14、f/f0） s= 2rp2(p-m)/ 9 (f/f0） dr/dtsw2 r S为沉降系数，表示单位离心力场下的沉降速率即通过单位离心力场所需的时间，因此单位为秒。,2019年1月18日星期五,SWAU,沉降系数的作用： 1、描述颗粒的大小 2、预计沉降时间 对已知S值的物质，可预计在离心管中的沉降所需时间。 3、 测定物质的分子量 根据Svedberg公式可计算出分子量。 M=RTS20,w/D20,w(1-V) R-气体常数，等于1.987卡/度.摩尔 T热力学温度 S20,w-标准状况下粒子的沉降系数 D20,w -理想状态时粒子的扩散系数 V- 微分比容，等于溶质粒子密度的倒数 -
15、溶剂密度,2019年1月18日星期五,SWAU,第四节、离心设备,离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。 根据转速的高低把离心机分为三种：低速离心机（转速在20006000r/min，最大RCF可达6000g）；高速离心机（转速在1800025000r/min，最大RCFd达60000g）；超速离心机（转速在40000100000r/min，最大RCF可达803000g）。 根据离心机的性能可分为：分析型，制备型和分析制备型。 转头可分为：角度转头，垂直转头，水平转头。 离心管及其管帽是转头重要的附件，制造离心管的材料主要有特种玻璃，塑料和不锈钢。,2019年1月18日星期五,SWA
16、U,2019年1月18日星期五,SWAU,2019年1月18日星期五,SWAU,2019年1月18日星期五,SWAU,第五节、制备型超速离心法,制备型超速离心法可以用来分离细胞，亚细胞结构或高分子。根据分离的原理的不同，制备超速离心法又可分为差速离心法和密度梯度离心法。 一、差速离心法 原理及操作步骤： 差速离心法又叫分级分离法。装有不均一的粒子的离心管在离心机中高速旋转时，大小，密度不同的粒子将以各自的沉降速率移向离心管底部。如果设计一定的转速和时间，沉降速率最大的首先沉淀在离心管底部，沉降速率中等及较小的组分继续留在上清液中。将上清液转移到另一离心管中，提高转速并掌握一定的时间，就可获得沉降速率
