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1、抗肿瘤药物筛选,张冬梅,一、导论 二、整体动物水平的筛选 三、细胞水平的筛选 四、酶水平的筛选 五、展望,一、导论,1. 肿瘤发病率和死亡率,全球每年癌症新发病例都在1200万以上，因癌症死亡人数达760多万，到2010年底全球肿瘤病人总数已逾5500万人 (WHO)。,心脏病,脑血管病,肿瘤 25%,消化系统病,肺病,其他,中国每年新增肿瘤病人200万人，死亡130-170多万人左右，目前全国肿瘤患者总数约450万人，并以每年3%的速度递增。肿瘤已经成为中国公民的头号杀手，每年因恶性肿瘤而死亡的人口占到总死亡率的22%。,2009年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成,(中国卫生年鉴),9年
2、中国常见恶性肿瘤的死亡率,我国居民常见癌症死亡率: 胃癌列肿瘤死亡率首位; 其次肝癌、肺癌、食管癌、结直肠癌等。,2. 肿瘤的治疗方法,外科手术治疗 放射线治疗 化学药物治疗,3. 常用的化疗药物,烷化剂 环磷酰胺、异环磷酰胺 抗代谢药物 甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷 抗肿瘤抗生素 柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星 铂类化合物 顺铂、卡铂、奥沙利铂 抗肿瘤植物药 长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇 激素类 血管新生抑制剂 贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼,化疗药物的主要不良反应,骨髓抑制（血细胞减少） 胃肠道反应（恶心、呕吐、食欲不振等） 全身反应（脱发、发热、皮疹） 对各器官影响
3、（心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性） 泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性肾病） 局部静脉炎 致畸、致突变、致癌,4. 天然产物与抗肿瘤药物,天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不可替代的作用，是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。 美国国立癌症研究所（NCI）从1955年开始从天然产物中筛选抗肿瘤药物。 目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中,以上来源于天然产物。,二、整体动物水平的筛选,非实体瘤动物模型,常用小鼠腹水瘤动物模型表（细胞株及动物） 国内外推荐模型,肿瘤移植方法：,1）无菌操作 2）接种部位：腹腔 3）癌细胞悬液的制备及接种 接种710天小鼠处死，酒精消毒，穿过腹 部肌肉
4、吸取腹水24 mL*，置冰块上保存。细胞计数后，PBS稀释制备1x107/0.1 mL细胞浓度悬液，每只小鼠注射0.2 mL 肿瘤细胞悬液注射到腹腔。5天左右，小鼠出现腹水即为造模成功。 *腹水应为白色浓稠液体，若为黄色或红色应弃去,给药及药效评价：,动物分组：随机分五组（溶剂对照组、阳性药组、高、中、低 给药组）；每组8-10只。 药品制备：药品溶解生理盐水或PBS等缓冲盐溶液 给药方式：连续给药；1-2次/天;（ig,ip,iv）14天以上 评价指标：观察记录荷瘤小鼠的存活天数（30天） （7天死亡率20%或20%动物存活超过4周，实验失败 对照组存活时间14-20天） 数据处理： 生命延
5、长率(%) 治疗组存活天数对照组存活天数 对照组存活天数 非腹腔给药生命延长率50% 腹腔给药75%,x100%,. 实体瘤动物模型,1）动物移植性肿瘤,常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表（细胞株及动物）,国内外推荐模型,肿瘤移植方法：,1）无菌操作 2）接种部位：右前肢腋下 3）癌块的制备及接种 接种710天小鼠处死，酒精消毒，切开皮肤取出肿瘤块，置于生理盐水中，冰块上保存。剪碎瘤块成2-3 mm3的小块或组织块匀浆成细胞悬液，接种到右前肢腋下。5天左右，小鼠出现瘤块即为造模成功。,7天后对照组20%小鼠肿瘤小于400 mg或大于2g，实验失败,给药及药效评价：,给药方式：连续给药；1-2次/天
6、;（ig,ip,iv）10-12天 评价指标：记录小鼠的体重变化。12天后，处死小 鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1 g左右）。 取脾脏和胸腺称重，并测定脾细胞数目 数据处理： 抑瘤率(%) 对照组瘤重治疗组瘤重 对照组瘤重 抑瘤率30% 认为有效,x100%,）人癌异种移植模型,细胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，结肠癌等肿瘤细胞 动物： 裸鼠 （nude mice） 特点： 1）裸体，行似无毛； 2）不能执行正常T细胞功能，免疫力低下 3）B细胞功能正常，NK细胞活性高,T淋巴功能缺陷 先天性无胸腺小鼠 11号染色体上隐性 突变裸基因（nu）,肿瘤移植和给药方法：,1）无菌操作 2）接种部位：背部 3）
7、细胞悬液的制备及接种 细胞悬液浓度1x108/mL，接种0.1mL到背部。7天左右，瘤块达到50 mm3体积即为造模成功，开始给药。 4）给药时间：根据药效确定，一般12-60天。,阳性药,5-Fu （5-氟尿嘧啶） ADM （阿霉素） Taxol（紫杉醇） CTX（环磷酰胺） 选择性对照药 推荐剂量：1-20 mg/kg 给药方式：与测试药物相同;常隔天给药,药效评价：,评价指标：记录小鼠的体重变化。结束治疗后，处 死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1 g左 右）。取脾脏称重，并测定脾细 胞数目。 数据处理： 抑瘤率(%)对照组肿瘤体积治疗组肿瘤体积 对照组肿瘤体积 抑瘤率30% 认为有效,x10
8、0%,抗肿瘤谱,Taxol （卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、淋巴瘤） 5-Fu （乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤） ADM （ 乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌）,沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用 (Carcinogenesis, 2013, 34:1331),三、细胞水平的筛选,1. 抑制肿瘤细胞增殖实验 2. 诱导肿瘤细胞分化实验 3. 诱导肿瘤细胞凋亡实验 4. 抗肿瘤血管生成实验 5. 肿瘤多药耐药性逆转实验 6. 抗肿瘤侵袭和转移实验 7. 诱导肿瘤细胞自噬实验,细胞株的选择,. 抑制肿瘤细胞增殖实验,A) 噻唑兰实验（MT
9、T） 原理： 活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的MTT，生成蓝紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶标仪在570 nm 处进行测定。甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。,MTT 原理示意图,甲臜生成量正比于活细胞数 采用比色法（570 nm）测定甲臜生成量,实验方法,1）细胞培养 培养液：RPMI 1640、DMEM、MEM、 M199、McCoys5A等 血清： FBS、NBS、 抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素、 新生霉素等 胰酶： Trypsin-EDTA 、Collagenase 缓冲液： PBS、HBSS等 生长因子：EGF、
10、B-27、N-2等,2）细胞传代 贴壁细胞生长3-5天，80%融合度。用胰酶消化1-3 min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养液中。 3）细胞计数 细胞计数板,5）细胞接种 3000-10000细胞接种在96孔板，贴壁 24小时，或对数生长期 6）加药处理72 h（指定时间点） 7）MTT溶液（5 mg/ml） ，孵育2-4小时 8）弃去培养液，加入DMSO溶解生成的 甲臜 9）酶标仪测定OD值,结果处理：,肿瘤细胞生长 抑制率（%）,=,（ OD对照-OD实验）,OD对照,X 100%,根据生长抑制的量效曲线求出IC50 值,肿瘤细胞存活率（%）=,OD实验,OD对照,X 100%,A,
11、B,问题：根据上图中细胞生长抑制曲线， 判断化合物A和B哪一个具有较好的 肿瘤生长抑制作用？,）磺酰罗丹明B （SRB）实验,原理： SRB是粉红色的氨基甲氧杂蒽类化合物，是蛋白结合染料，与蛋白质的碱性氨基酸结合后呈粉红色，用酶标仪测定其吸光度。 细胞中的蛋白含量与吸光度成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目和活性。,方法： 类似于法，10-20%三氯乙酸固定1 h 后，加入0.5-1%染色30 min，洗去 染料，空气干燥后，加入10 mM Tris 溶解 后，50 nm测定光密度 结果处理：同法,）细胞排染法（酞酚蓝）,原理： 细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正 常细胞排染，
12、而死亡细胞染成蓝色。,伊红、苯胺黑 等染料,细胞死亡率 （%）,对照组活细胞数给药组活细胞数,对照组活细胞数,X100%,=,结果：,方法： 细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板，分别计数活细胞（未染色）和死细胞数目（蓝色）,. 诱导肿瘤细胞分化实验,NBT还原法 原理：硝基蓝四氮唑兰(NBT) 还原法测定细胞株分化 诱导。正常的中性粒细胞内磷酸戊糖支路活跃, 细胞内还原型辅酶含量增加, 将可溶性NBT还原 为不溶性蓝紫色颗粒, 而沉积于细胞浆内。 方法：HL-60 细胞株是筛选分化诱导剂的,药物作用后, 细胞形态向粒细胞方向分化。 结果：显微镜计数NBT还原阳性细胞，计算诱导分化率,对
13、照组,药物处理组,. 诱导肿瘤细胞凋亡实验,）形态学观察（透射电镜） 原理：细胞超微结构观察 方法：药物处理后，收集细胞，4%戊二醛固定2 h以上，PBS清洗，1%俄酸固定1 h,酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，切片做成铜网，经醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜下观察拍照。,对照组,凋亡细胞,正常细胞胞质散在内质网、核膜清楚、染色质均匀、核仁明显。,凋亡细胞染色质浓缩、致密，沿核分布形成新月体状，有凋亡小体出现。,对照组,坏死,线粒体肿胀,凋亡细胞胞质出现明显的线粒体肿胀。,坏死细胞细胞膜不完整，核膜破裂，染色质呈虫蚀状溶解。,B）DNA形态观察（Hoeschst333258） 原理： Hoesc
14、hst333258与DNA特异性结合发出蓝色荧光 方法：肿瘤细胞用Hoeschst333258染色后，在荧光显微镜下观察 结果：活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞核或细胞质内可见强荧光的颗粒状物质。,对照组,药物处理组,C）染色体断裂测定,原理：凋亡细胞内源性核酸酶激活，链被切割成200 bp不同倍数的片段，将这些片断进行电泳，可观察到梯带 方法：裂解肿瘤细胞，消化蛋白，提取，上凝胶电泳，染色后，灯下观察。 结果：凋亡细胞显示梯带。,CTL,DRUG1,DRUG2,MARKER,）PI/Annexin-FITC双染色分析,原理：调亡细胞磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞 表面，PS结合标记荧光素FIT
15、C的Annexin-V 但细胞膜仍然完整，荧光染料不能进 入，而调亡晚期的细胞可同时受Annexin-V 和PI的双标记。 方法：肿瘤细胞同时加入Annexin-和染色， 用流式细胞仪分析。,正常细胞 Annexin-V (-) PI (-),晚期凋亡细胞 Annexin-V (+) PI (+),早期凋亡细胞 Annexin-V (+) PI (-),Annexin-V,PI,PI/AnnexinV-FITC 双染激光共聚焦分析结果,PI红色荧光细胞核,AnnexinV-FITC 绿色荧光 细胞膜,Annexin-V-FITC,PI,对照组,药物处理组,. 抗肿瘤血管生成实验,肿瘤发生、生长
16、和转移与新生血管形成密切相关，当肿瘤直径超过2 mm时,直接由微环境提供的营养就不能满足其生长需要,此时肿瘤的生长依赖于新生血管运送营养物质。 肿瘤血管生成抑制剂能抑制血管生成,阻止肿瘤生长和转移，在治疗肿瘤中具有高效、广普、副作用小、不易产生耐药性等优点。,）血管内皮细胞体外筛选模型,原理：体外培养的血管内皮细胞在含生长因子条件下 能形成细胞条索，然后形成管状。肿瘤血管生 成抑制剂能抑制细胞管腔的形成。 方法：人脐静脉血管内皮细胞在含有药物和不含有TAI 药物的胶原凝胶中分别培养后,在显微镜下比较 它们形成的管腔数目。,对照组,药物处理组,）鸡胚绒毛尿囊膜血管新生模型,原理：鸡卵在胚胎发育过程中，尿囊膜上的血管生长 很旺盛，将不同药物作用于尿囊膜，观察
