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1、第 五 章 核酸化学,化学化工院：冉秀芝,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大 分子，携带和传递遗传信息。,是生物体内一类含有磷酸基团的重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。 是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,本章教学目的要求,1.掌握： （1）DNA的二级结构特点 （2） mRNA和 tRNA的结构特征及主要功能 2熟悉： （1）DNA的三级结构：核小体的结构特点 （2）DNA的理化性质及其与结构的关系 3.了解： （1）核苷酸的分子构成、连接方式及书写方式； （2）核酸酶,重点：掌握核酸构件分子的结构特点、代 号；
2、掌握DNA二级结构特点、稳定力、三级结构特点及有关概念；掌握RNA二级结构特点、类型；了解核酸的重要理化性质。 难点：构件分子的结构特点，DNA二级结构要点及三级结构有关概念，tRNA二级结构特点、真核生物mRNA二级结构特点，核酸理化性质中涉及的概念及应用。,本章重点及难点,第一节 概 述,染色体、基因和DNA 核酸的化学组成,一、染色体、基因和DNA,染色体和基因遗传的基本单位 核酸遗传信息的载体,如何证明核酸是遗传物质的载体？,年O.T.Avery的细菌转化实验是获得DNA携带遗传信息的第一个证明； 年Alfred D.和Hershey等人建立的T2噬菌体捣碎的实验，这是第二个证据，证明
3、噬菌体复制的物质是DNA而不是蛋白质外壳； 1953年 Watson和Crick的DNA双螺旋模型的发现，更进一步揭示了DNA作为遗传物质储存和信息传递的化学机制； 核酶的发现，一些核酸本身具有酶催化的活性。,1944年，Avery的转换转化实验,or,and,可分离,二、核酸的化学组成,元素组成 C、H、O、N、P（910%）,1. 分类核酸分为RNA和DNA,核糖核酸 （RNA）：,脱氧核糖核酸（DNA）：,m RNA（信使 RNA ） 5 % Pr合成的直接模板,t RNA （转运 RNA ） 15 % 转运Aa,r RNA （核蛋白体 RNA） 80 % 充当装配机，提供场所,细胞质，
4、参与蛋白质的生物合成。,核内染色质，遗传的物质基础， 决定遗传特性。,基因 DNA分子中的 功能 片段。,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,2. 核酸中的糖戊糖,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),3. 含氮碱基嘌呤和嘧啶衍生物,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),核苷： AR, GR, UR, CR 脱氧核苷： dAR, dGR, dTR, dCR,4. 核苷酸核酸的基本结构单位,核苷酸： AMP
5、, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,（2）核苷酸的种类,核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,5. 核苷酸的衍生物,含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,环化核苷酸: cAMP，cGMP,AMP,ADP,ATP,cAMP,6.核苷酸的重要作用,核苷酸是合成DNA和RNA的前体； UDPG、CDP-甘油二酯、 S-腺苷甲硫氨酸参与多糖、磷脂和卵磷脂的生物合成 ATP是生物体内生物能生成、储藏、转运的中心； 各种代谢反应中所需的N
6、ADH、HSCoA、FAD、都是腺苷酸的衍生物 cAMP在生物体内具有传递信息的作用 GTP是生物大分子移位反应的主要动力来源,第二节 核酸的结构,一、核酸的一级结构,定义 核酸的一级结构是指核苷酸的排列顺序，包括核苷酸之间的连接键。 由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,1.磷酸二酯键核苷酸之间的基本连接,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的3-醇羟基与另一个核苷酸的5-磷酸基形成3,5 -磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,多聚核苷酸的结构特征,主链是相间出现的磷酸戊糖残基通过共价键连接； 各种碱基排在主链外侧； 磷酸二酯键在主链中取向相同从53； 线性结构有3和5末端，即在3位置
7、上缺乏核苷酸残基，5末端即在5位置上缺乏核苷酸残基。3端有游离的羟基，5端有游离的磷酸基。,2.一级结构核苷酸的排列顺序,书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,5-磷酸端（常用5-P表示），3-羟基端（常用3-OH表示）； 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35； 戊糖用垂直竖线表示，五个C从上到下依次为15。,线条式缩写,字母式缩写,二、核酸的高级结构,DNA的二级结构双螺旋结构模型 tRNA二级结构三叶草结构模型 DNA的三级结构超螺旋,（1）DNA双螺旋结构模型提出的依据,1. DNA的二级结构双螺旋结
8、构模型,碱基互补配对,T,A,G,C,（2） DNA双螺旋结构模型的特征 （Watson, Crick, 1953）,主链：两条反相平行的脱氧多核苷酸链围绕同一“中心轴”相互缠绕，形成双螺旋；两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，碱基对位于双螺旋内侧；两条链均为右手螺旋，其磷酸二酯键的方向相反。,碱基配对：碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; GC） 。 碱基参数：螺旋直径为2nm，相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。 螺旋表面：形成大沟(宽1.2nm，深0.85nm)及小沟(宽0.6nm，深0.75nm)相间。,（3）DNA双
9、螺旋结构的稳定因素,氢键维持双链横向稳定性， 碱基堆积力使双螺旋内部形成疏水区域，利于碱基间形成氢键，是维持DNA双螺旋稳定的主要因素。 离子键能减少双键间的静电排斥，有利于双螺旋稳定。,B型结构 两条链反向平行，右手螺旋 碱基在内（AT，GC）碱基平面垂直于螺旋轴 戊糖在外，双螺旋每转一周 为10.5个碱基对（bp） A型结构 碱基平面倾斜20，螺旋变粗变短，螺距23nm。 Z型结构 左手螺旋，只有小沟,（4）DNA双螺旋结构的类型,双螺旋DNA的结构参数,双螺旋稳定的力 氢键 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力） 离子键等 DNA变性剂（热、pH、脲/酰胺、有机溶剂）,氨基酸接受区,可变区
10、,2. tRNA二级结构 三叶草结构模型 四臂四环 氨基酸接受区（1臂） 反密码区（1臂1环） DHU区（1臂1环） TC区（1臂1环） 可变区（1环）,* tRNA的三级结构 倒L形,* tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,3 DNA的三级结构超螺旋,定义：DNA的三级结构是指双螺旋基础上分子的进一步扭曲或再次螺旋所形成的构象。超螺旋(superhelix) 是常见的形势之一。 形成：DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺 旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构的一个重要特征。,正超
11、螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,核酸性质及纯度测定,第 三 节,一、核酸的溶解性,溶解性碱基、核苷酸和核酸具有不同的溶解性 0.14摩尔法分离DNA蛋白和RNA蛋白的方法,多价解离体内的DNA呈多阴离子态 带电性：可用电泳、离子交换（色谱）分离,二、核酸的解离,三、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 以A260/A280进行定性
12、、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光,2.定量测定核酸和核苷酸测定的基本方法,DNA的变性过程,1. DNA变性DNA生物学功能实现所必需,定义：在某些理化因素作用下，稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，DNA双链解开成两条单链的过程。,四、DNA的变性与复性(denaturation),因素：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,A260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液A260
13、增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,DNA的熔解温度(Tm),定义：在熔解曲线中，当A260达到最大值一半时，所对应的温度。 影响Tm的因素 DNA的均一性 介质中的离子强度 G、C的含量 DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关，经验公式计算： （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,2. DNA的复性核酸研究中的常用手段,定义：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，并恢复有关的性质和生理功能，这个过程称为DNA复性。,减色效
14、应 DNA复性时，其溶液A260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,粘度,五、核酸的含量与纯度鉴定,核酸含量的测定定磷法、定糖法 定磷法：核酸含量=总磷含量10.5（100/9.5） 测定范围：10100g核酸 定糖法：RNA:D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色物质 DNA:D2脱氧核糖酸二苯胺蓝色物质 测定范围：RNA,20250g;DNA,20250g DNA纯度的鉴定凝胶电泳 紫外吸收法测核酸纯度： DNA纯品: A260/A280 = 1.8 RNA纯品: A260/A280 = 2.0 凝胶电泳法鉴定DNA纯度： 纯DNA样品只有单一的一条带
15、，否则为非单一的谱带,DNA碱基序列测定方法 测定的基本步骤 链终止法（SangerCoulson方法） DNA的化学降解法（Maxam-Gilbert） 自动DNA测序 RNA碱基序列测定的方法,六、核酸碱基序列的测定,Sanger等1977年发明。,链终止法,Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖,（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配 对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。 （4）2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终 止。,1） 原理,（1）制备单链DNA模板,2） 技术要点,就是待测序的 DNA链。,不能有53和35的外切酶活性； 与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。,（3）特殊的DNA多聚酶,dNTP / ddNTP = 100 / 1,（4）制备2和3双脱氧的ddNTP,时, DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。,需带有放射性或荧光标记。,（2）制备一小段单链引物（DNA或RNA）,3. Sanger双脱氧终止法测序过程,模板序列,（1）非放射性标记,1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。,DNA自动化测序,荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。,1）技术要点,（2）不同的标记对象,既可标记引物，也可标记ddNTP。,（4）分析自
