《生化分离工程4. 色谱分离》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化分离工程4. 色谱分离（108页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、4. 色谱分离,Chromatographic resolution 也称色谱法（chromatography） 色谱分离是分离科学的一次革命。,主要内容,4.1 概述 4.2 色谱分离的分类 4.3 生物工程中的色谱分离 4.4 色谱分离的基本理论 4.5 吸附色谱 4.6 离子交换色谱 4.7 分配色谱 4.8 凝胶色谱 4.9 高速逆流色谱 4.10 径向色谱分离法 4.11 连续环状色谱分离法,4.1 概述,4.1.1 色谱法的定义 4.1.2 色谱法的发展简史 4.1.3 色谱法的特点,4.1.1 色谱法的定义,色谱法chromatography 是利用混合物中各组分在两相中分配系数
2、不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。,凡是色谱分离都具有stationary phase和mobile phase 。 固定相是不动的，流动相对固定相作相对的运动。 被分离的组分与流动相和固定相有不同的作用力。这种作用力有吸附力，溶解力 ，离子交换能力等。在色谱分析中常用分配系数来描述组分对流动相和固定相的作用力的差别： K= Cs/Cm 分配系数的差异是色谱分离的根本原因。,4.1.2 色谱法的发展史,色谱法的诞生 常见的分离方式如过滤、蒸馏、沉淀、结晶、离心、萃取、膜分离等在分离复杂的混合物时就显得力不从心了。 190
3、3年，M. C. Tswett 进行了分离植物叶中各 种色素的实验。创立了 色谱法。,It is very instructive to observe the adsorption phenomena during filtration through a powder. First a colourless, then a yellow （carotene） liquid flows out from the bottom of the funnel, while a bright green ring forms at the top of the inulin column, belo
4、w which a yellow ring soon appears. On subsequent washing of the inulin column with pure ligroin, both rings, the green and the yellow, are considerably widened and move down the column. M.S. Tswett Tr. Varshav. Obshch. Estestvoispyt., Otd. Biol., 14 （1903） 20,然而，在20多年时间里，他的新分离方法并没有受到科学界的重视。其中一个重要原因
5、是德国著名化学家R. Willsttter对色谱法的排斥和不信任。 Willsttter（1915年获诺贝尔化学奖获得者）1913年在其名著“叶绿素的研究”中，称色谱法是一种“离奇的方法”，认为它不适用于制备工作，在吸附过程中，试样组分可能发生化学变化。他写道：“色谱法只能在试样很少的情况下使用，似乎不适合于制备目的” Willsttter的观点，即过分强调制备工作，也反映出当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的技术是超越其时代的。,1930年12月，奥地利22岁研究生E. Lederer到海得堡R. Kuhn领导的化学研究所研究类胡萝卜素。他对文献进行了仔细考察，从文献中了解到茨维特的
6、色谱技术。在Kuhn的指导下，他用碳酸钙作吸附剂，在一小色柱中，成功地分离了-、-、-胡萝卜素，并发表了三篇论文，公布了他们的研究成果。这标志着色谱法的复兴。 Karrer在1937年，Kuhn在1938年，Ruzicka在1939年相继获诺贝尔化学奖。从此以后，色谱法得到普遍的公认，成为最有效的分离提纯手段。,色谱法的发展 1931年，Kuhn、Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了-、-、-胡萝卜素后才引起重视。Tswett的方法是借助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行分离的，称为吸咐色谱adsorption chromatography。 1935年，Adams和Holmes 合成
7、了离子交换树脂，并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色谱法。,1941年A. J. P. Martin和R. L. M. Synge发明了分配色谱法（partition chromatography）。1952年获诺贝尔化学奖。,Archer John Porter Martin,Richard Laurence Millington Synge,1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的可能性。 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱法gas-liquid chromatography。 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法open-t
8、ubular column chromatography，即毛细管柱气相色谱法capillary column chromatography。 1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论。 1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论。,1944年R. Consden、A. H. Gorden和Martin等发展了纸色谱。 1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（thin layer chromatography）得以实际应用，1956年E. Stahl对TLC的标准化、规范化及应用面做了大量工作并开发出薄层色谱
9、板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。 1959年Porath和Flodin提出了凝胶色谱法（ gel chromatography ）。 1967年Porath、Axen和Ernback成功地创立了亲和色谱法（ affinity chromatography ）。,20世纪60年代初，Giddings将气-液色谱理论用于液-液色谱，同时把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱， 于60年代末出现了高效液相色谱（HPLC）。 20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，90年代未得到较广泛的应用。 20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（Capil
10、lary electrophoresis，CE），在90年代得到广泛的发展和应用。 同时集HPLC和CE优点的毛细管电色谱在20世纪90年代后期受到重视。,4.1.3 色谱法的特点,分离效率高 可选操作参数多 应用范围广 高灵敏度的在线检测快速 分离与过程自动化操作,4.2 色谱分离的分类,按分离机理不同分类 按固定相及流动相的状态分类 按固定相形状分类 其他分类方法,4.2.1 按分离机理不同分类,吸附色谱 Adsorption chromatography，AC是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 吸附作用力可以是物理吸附作用，也
11、可以是化学吸附作用。物理吸附的特点是选择性低，吸附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条件下也可以互相转化。,吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸附剂。 在此基础上发展起来的新的吸附色谱技术，如疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）、金属螯合作用色谱（metal chelation chromatography，MCC）和共价作用色谱（covalent interaction chromatography，CIC）
12、等，所用吸附剂一般为有机基质并通过化学修饰后制成，它们都有比较明确的作用机理，即疏水作用、螯合作用和共价作用。,离子交换色谱 离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）是基于离子交换原理进行的色谱分离。广泛用于生物大分子的分离纯化中。,亲和色谱 亲和色谱（affinity chromatography，AFC）是将与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相从混合物中分离目的产物的过程。 亲和作用是特殊的吸附作用。,分配色谱 Distribution chromatography，DC又称为液液色谱，其原理是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同
13、而分离。 分配色谱可分为正相色谱（normal phase chromatography，NPC）和反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）。 离子对色谱ion-pair chromatography。,凝胶色谱 凝胶色谱（gel chromatography，GC）以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱（molecular sieve chromatography，MSC）；空间排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）。 凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel fil
14、tration chromatography，GFC）和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC） 。,电色谱 电色谱（electrochromatography）是电泳和液相色谱的融合技术。所谓电色谱是采用电渗流来推动流动相，使得峰扩展只与溶质扩散系数有关，因而使电色谱的理论塔板数远远高于液相色谱。同时由于引入了高效液相色谱的固定相，使电色谱具备了高效液相色谱固定相所具有的选择性，使它不仅能分离带电物质。也能分离中性化合物。,4.2.2 按固定相及流动相的状态分类,气相色谱GC 气相色谱（gas chromatography，GC）仅限于能够气化的物质
15、，且主要用于分析。气相色谱包括气液色谱GLC、气固色谱GSC。 液相色谱LC 液相色谱（liquid phase chromatography，LPC）可分为液液色谱LLC、液固色谱LSC。 超临界流体色谱 超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）是20世纪80年代中期发展起来的一种新的色谱分离技术，其流动相为超临界流体。,4.2.3 按固定相形状分类,柱色谱（column chromatography） 平面色谱（planar chromatography） 纸上层析（paper chromatography ） 薄层色谱 （thin l
16、ayer chromatography）,4.2.4 其他分类方法,按使用领域不同对色谱仪的分类 1. 分析用色谱仪 又可分为实验室用色谱仪、在工业生产流程中为在线连续使用的色谱仪和便携式色谱仪。 2. 制备用色谱仪 又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪。制备型色谱仪可以完成一般分离方法难以完成的纯物质制备任务，如纯化学试剂的制备，蛋白质的纯化。,根据操作压力不同进行分类 可分为低压色谱分离（0.5 MPa）、中压色谱分离（0.55 MPa）和高压色谱分离（550 MPa）。 低压色谱分离的装置比较简单，操作费用低，但流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生物活性物质活性降低。 高压色谱分离技术的特点是，流动相流动速率高，分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂贵，此外在高压作用下有些生物物质有变性的可能。,根据展开方式进行分类 根据洗脱操作时展开方式的不同可分为为洗脱展开（elution development）、迎头分析（frontal analysis）和顶替展开（displacement d
