第三章 基因工程载体,定义 基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”也称DNA克隆载体 必备条件 1、克隆位点(一个或多个) 2、能携带外源DNA片段进入受体细胞: 能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制 3、有选择克隆子的标记基因 4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞) 意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域按克隆载体的来源分： 质粒～ 病毒或噬菌体～ 质粒与病毒或噬菌体DNA组成的～ 质粒与染色体DNA片段组成的～,按应用范围分： 表达型～ 启动子探针型～ cDNA ～,按应用对象分： 原核生物～ 植物～ 动物～,分 类,３.１ 质粒克隆载体 定义： 以质粒DNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和c DNA基因文库一、质粒适于载体构建的性质 １、组成与构型 是染色体外裸露的双链DNA分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）,构型：,l-DNA,oc-DNA,ccc-DNA,２、分子大小： 100～102 kb,３、复制 特点：在宿主细胞内； 单向； 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制,复制 (Replication) 质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制的。
质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点(ori)，二是调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定 严紧控制型：1~数个拷贝；大质粒 松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒 经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）４、质粒的不亲合性 亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒 不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒 意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒 ５、质粒迁移 （１）接合质粒： 含tra基因→合成细胞表面物质（鞭毛）→质粒DNA入受体细胞 含tra基因的质粒称为接合质粒如F、Ti等 不含tra基因的质粒称为非接合质粒如ColE1、pPbS等,（２）迁移作用 不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非结合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞这种现象称～,质粒的迁移作用,６、显性质粒和隐蔽质粒 宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。
显性质粒 Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的抗性基因，可作为选择标记 Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒 隐蔽质粒 蓝藻内源质粒,二、 理想质粒载体的必备条件 １、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等,三、质粒载体构建 过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组） 构建原则 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子 5、构建过程力求简单 代表性实例一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建 Ⅰ、pBR322构建 质粒载体命名法则 “pBR322” p：质粒（plasmid ) BR：两位主要构建者 322：实验编号 pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧型 ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂,构建过程(出发质粒：pMB1),R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19 （含易位子Tn3 Apr） R1drd19 Tn3 pSF2124 ColE1 pBR322的三个亲本：pMB1、pSF2124、pSC101 识别位点： Apr基因区（3个 ）： PstⅠ、Sca Ⅰ 、Pvu Ⅰ Tcr基因区（7个 ）：BamH Ⅰ 、Scal Ⅰ 、EcoRⅤ、 Sph Ⅰ 、Nhe Ⅰ 、Nru Ⅰ 、XmaⅢ Tcr启动子区（2个 ）：Cla Ⅰ 、HindⅢ pBR322分子大小：4363bp,,,3、优点 （1）较小的分子量 10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA （2）较高的拷贝数 经氯霉素扩培后达1000～3000 copys/cell （3）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。
插入失活（图解）,Ⅱ、pUC18/19质粒载体 与pBR322区别：乳糖操纵子的一个DNA片段（lac Z`基因）替换Tcr基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆 命名p UC——University of California的科学家首先构建图3-3 pUC包括四个组成部分： （1）pBR322的复制起点(ori) （2）Apr基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点 （3）lacZ`基因 （4）在lacZ`基因 内部靠近5`端有一段MCS连杆,4、pBR322衍生的质粒 缺失bom位点→ pBR325、 pBR327，不具被动迁移作用 再移去HaeⅡ片段→pAT153 均更安全,Lac Z`筛选机制： 含乳糖操纵子的启动子、调节因子和 β-半乳糖苷酶的N端146残基(α-肽) 合成有活性的 基因（lac Z`）的质粒载体引入可编 β-半乳糖苷酶 码C端部分残基的宿主(与Lac Z`互补 的大肠杆菌) 在含IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖） 蓝色菌落 的诱导培养基上培养 在N端α-肽的编码区插入MCS 不影响lac Z`基因功能 插入外源DNA 灭活lac Z`基因 白色菌落,,,,,,,,,pUC质粒载体的优点 （1）分子量更小、拷贝数更高 （2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时 （3）MCS区方便转移外源DNA在不同载体系列中 “穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源DNA 能直接克隆入p UC载体,（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2的构建 大肠杆菌质粒不能转化蓝藻 蓝藻内的质粒属隐蔽质粒 即：大肠杆菌源质粒复制起始点 + 蓝藻源质粒复制起始点。
pPbs（1511bp） pPbs ClaⅠ 重组 pPRS-1 多次亚克隆 pPKE-2 pBR322 组装CaMV35s启动子、MCS、rbcS终止子、Kmr基因 （图3-5）,,,,↑,,构建穿梭质粒,,,（三）农杆菌Ti质粒克隆载体的构建 Ti质粒：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称Tumor inducing plasmid（Ti质粒）双链环状DNA分子，200～250kb 1、4个功能区：T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区 （1）T-DNA区 Ti质粒进入植物细胞的约25kb部分，即T-DNA （transfer DNA)左右边界各有一个25bp正向重复序列（LTS和RTS）称为边界序列，为T-DNA的转移和整合所必需只要保留T-DNA的边界序列，中间序列被外源DNA片段替换，仍可转移整合到植物基因组中 这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据 用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选育转基因植物2）Vir区 位于T-DNA区上游，其表达产物可激活T-DNA的转移，显示致瘤性 （3）Con区 含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)，可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌间转移，也即接合转移基因编码区。
（4）Ori区 复制起始区，调控Ti质粒自我复制 Ti质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作用2、构建途径 （1）取代型载体 用大肠杆菌质粒克隆载体取代Ti质粒的全部或部分T-DNA序列而构建外源基因以同源交换而重组 Onc- Ti：T-DNA上的onc基因被取代而构建 Onc+ Ti：pBR322取代 T-DNA的部分序列但保留onc基因而构建进入植物细胞诱发冠瘿瘤2）中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒,3．2 病毒（噬菌体）克隆载体,病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体 分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒： 溶原性增殖→构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖→改造后,,,,,噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫做 Bacteriophage（简称 phage）它的DNA分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因 如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA 噬菌斑，即感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。
分离重组体噬菌体的基本过程,首先是使用无菌消毒的金属接种针，粘着少量的噬菌体颗粒，转移到新鲜的细菌培养基中，使其在感染的细胞内大量地增殖 采用密度梯度离心法，便可非常容易地纯化出噬菌体的颗粒一、 λ噬菌体克隆载体,λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体 λ噬菌体的分子量为 31 ×106dal，是一种中等大小的温和噬菌体λ噬菌体基因组的结构,在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端 注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子 随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）,λ噬菌体克隆载体,,（一） λ噬菌体性质 λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点),,迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因； 另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因（介于基因J和基因N之间）。
2、λ噬菌体基因组有基因50个以上,λ噬菌体DNA的复制,在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制 到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的长多连体分子λ噬菌体DNA的转录与转译,在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的 大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期； 中期基因转录的结果导致 DNA进行复制和重组； 晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒3、 限制性核酸内切酶位点: 56种 4、 λ噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶原生长途径→某种胁迫条件下→合成six 基因产物→λ DNA脱离细菌染色体→溶菌,,（二）构建依据 1、λ噬菌体是一种温和噬菌体 2、能承载较大的外源DNA片段 λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点 （三）构建的基本策略与技术路线（P54） 策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统λ噬菌体载体的构建及其主要类型,插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。
替换型载体（rePlac。