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1、,分子肿瘤学 第六节 细胞信号转导与肿瘤,外部信息传入细胞内并引起细胞应答反应的过程称为信号转导（signal transduction). 各类信号通过细胞膜和细胞内信使分子引起一系列生物化学反应，引起细胞基因表达改变，继而产生相应的生理病理效应。 细胞信号转导过程发生障碍或异常，可导致细胞生长、分化、代谢和生物学行为的异常，引起各种疾病，乃至肿瘤。,一、信号转导异常与肿瘤概略,（一)促细胞增值的信号过强,1、细胞外信号分子与肿瘤 细胞外信号分子如生长因子产生过的，使细胞增值的信号转导过强，如： （1）血小板源生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF)
2、:某些肿瘤如肉瘤、神经胶质瘤产生和释放大量的PDGF，并表达其受体，使细胞脱离外来生长信号的调节，成为“自我刺激”生长的细胞 （2）血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) VEGF的高表达对肿瘤血管生成非常重要 （3）成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor,FGF) FGF家族通过“自分泌”（Auocrine effect)机制激活受体酪氨酸激酶来参与细胞的恶性转化,2、受体改变与肿瘤,（1）某些生长因子受体表达异常增多 如多种肿瘤组织中发现有编码EGFR的原癌基因c-erb-B的扩增及EGFR的过度表
3、达； （2）突变使受体组成型激活 如多种肿瘤组织中证实有RTK的组成型激活,3、细胞内信号转导蛋白的改变,如小G蛋白（Smgs)在信号转导中起重要作用，Ras蛋白的基因突变使Ras自身GTP酶活性下降，造成Ras-Raf-MEK-ERK通路的过度激活，导致细胞的过度增殖与肿瘤发生。,（二）抑制细胞增值的信号转导过弱,生长抑制因子受体减少、丧失 受体后信号转导通路异常,细胞的生长负调控机制减弱或丧失,二、转录因子与肿瘤,一个细胞能在特定时间中多水平调控蛋白质表达，包括RNA转录、RNA加工、RNA翻译，RNA降解及翻译后水平调节，其中最为重要的是转录调控，即调控一个基因何时以及如何被转录。转录调
4、控异常是肿瘤发病机制的重要环节。,（一）转录因子的几个基本问题,1、转录因子的修饰：转录因子的磷酸化是最重要的蛋白质修饰方式，蛋白质磷酸化可影响转录因子功能的多个方面 （ 1）、核定位的调节：胞浆中的转录因子与抑制亚基结合，磷酸化使核定位功能区暴露，如NF-kB与IkB的结合 （2）、DNA结合活性的调节 （3）、转录活性的调节,2、转录因子的活化方式 （1）组成性活化（ constitutive activation):在没有明显外在因素影响下，细胞中所呈现出的转录因子的活化状态 （2）诱导性活化：在明显外在因素影响下，细胞内某种转录因子的表达和活化显著不同于非诱导状态 （3）组成性激活突变
5、（constitutively activated mutation某些信号转导蛋白在突变后获得了自 发激活和持续性激活的能力。,（4）显性负性作用（dominant negative effect）：某些信号转导蛋白突变后不仅自身无功能，还能抑制或阻断野生型信号转导蛋白的 作用。这种作用被称为显性负性作用。具有显性负性作用的突变被称为显性负性突变（dominant negative mutant)。,NF-kB家族与肿瘤,NF-kB家族广泛调控一系列基因的表达，尤其是免疫反应、炎症反应、与病毒有关的癌基因、抑癌基因的表达。在多种肿瘤组织中NF-B是组成性活化的， NF-kB的异常活化通过干扰
6、细胞周期、细胞凋亡等途径在肿瘤的发生和发展中起重要作用。目前的研究表明，NF-B参与了癌症的恶性转化，NF-B还可能通过促进肿瘤血管生成、侵袭、转移来促进肿瘤的演进，在肿瘤的抗药机理中也起作用。,（一）NFB家族及信号通路,1、NFB家族 NFB是由一系列同源或异源Rel家族成员形成的二聚体转录因子的总称，在哺乳动物细胞中已发现Rel/NF-kB家族的5个成员：p65(RelA)、RelB、c-Rel、p50(NF-kB1)、p52(NF-kB2)。 NFB家族中，异源二聚物p50/RelA(p50/p65)表达最丰富，通常把p50/p65二聚体称为NFB。,2、NFB的结构特点 NFB 5个
7、成员都有一个高度保守的Rel同源结构源（Rel homology domain,RHD），内含DNA结合区、蛋白二聚体化区、NFB的抑制蛋白（IB）结合区及核定位信号。其中p50，p52分别来源于前体蛋白p105，p100，它们的C端包含锚蛋白重复序列；而RelA，RelB及c-Rel的C端含有反式激活区域。 NFB在DNA的特异性结合位点称B位点，其核心结合序列为GGGACTTCC， NFB家族成员的B位点略有差异。,3、 NFB 活化,（1）NFB活化通路 静息状态下， NFB在胞质中以同源或异源二聚体的形式与抑制蛋白I kB结合,呈无活性状态。在外界因素如脂多糖（LPS）、白介素1（IL
8、1）、肿瘤坏死因子（TNF）的刺激下，受体与配体结合，进而激活NFB 诱导性激酶（NIK），进而激活IB激酶（IKK与 IKK）复合物，引起IB蛋白特异丝氨酸位点 的磷酸化（ IKK Ser32 、Ser36 ，IKK Ser19 、Ser23） ，磷酸化IB从三聚体中解离下来并泛素化降解，暴露p50亚基的核定位序列及p65亚基的DNA结合位点，使NFB活化可以从胞浆移位至细胞核与DNA特异位点相结合，参与转录进程。,（2）NFB的活化的反馈调节 能够上调IB的mRNA水平，新合成的IB进入胞浆与游离的NFB结合并使之失活，细胞通过这种自身的反馈调节途径调节NFB的活性以维持细胞的正常生理功能
9、。,（二） NFB信号转导通路的异常与肿瘤的发生与发展,大量研究表明,IKK/ I kB /NF-B信号转导通路的异常可以促进肿瘤的发生发展.许多炎症因子、致癌剂、促癌剂和肿瘤微环境都可以激活NF-B.NF-B蛋白本身和其调控的蛋白与肿瘤的发生、增殖、抗凋亡、侵袭、血管生成和转移有关。在多种肿瘤中NF-B都处于持续性激活状态。,1、癌基因介导的恶性转化及肿瘤的演进需要NF-B的参与 Ras-转化过的细胞通过H-Ras激活NF-B来抑制凋亡；HTLV-1TAX使得大鼠成纤维母细胞恶变也需要NF-B的激活；癌基因激活后BCR-ABL溶合蛋白形成也需要NF-B的激活；NF-B的激活可能是细胞及病毒癌
10、基因产物发挥功能的重要基础。支持这一观点的实验有:抑制了NF-B就会抑制了许多造血系和实体瘤细胞系的生长和存活，促进凋亡。,2、 NF-B活化与细胞周期异常,（1） CyclinD1 在多种肿瘤中过表达。CyclinD1启动子含有3个B位点， NF-B活化具有促进CyclinD1表达及G1/S期转换的功能。外界致瘤因素导致NF-B活化继而调节CyclinD1的过表达，缩短G1期，促进细胞转化。 （2）CyclinD1启动子区还有两个AP-1结合位点，3个SP1结合位点，这为从Cross-talk角度调节CyclinD1表达，导致细胞周期紊乱提供了分子基础。,3、 NF-B活化、细胞凋亡与肿瘤,
11、细胞凋亡对机体自稳态的维持和肿瘤发生的抑制起着重要作用。NF-B的一个重要功能是参与正常细胞凋亡的调控。 NF-B是凋亡通路的核心调控成员，一方面受到死亡受体信号的调控，另一方面以反式激活的方式调节下游的抗凋亡基因。通过抑制细胞凋亡， NF-B促进肿瘤的发生发展,(1）EB病毒、HCV 病毒等可激活NF-B相关的信号途径，抑制Fas/TNF等介导的凋亡 (2） NF-B 调控Survivin的表达 Survivin是近年来发现的一种凋亡抑制蛋白的成员，它在胚胎和发育的胎儿组织中表达，在终末分化的成人组织中不表达，但在大多数的肿瘤组织和转化细胞中大量表达； Survivin的表达与细胞凋亡、细胞
12、增殖、胚胎发育、血管生成、免疫调节和肿瘤抑制等许多方面都有着广泛的联系。 Survivin对凋亡的抑制与肿瘤预后差、存活 期短密切相关。 Survivin的启动子区具有多个转录因子结合位点，包括NF-B、AP-1。 NF-B使Survivin过表达，促进其核移位，使细胞Rb磷酸化增加,促进细胞S期转化,促进细胞增殖;也可通过抑制caspase3活化而抑制细胞凋亡 Survivin为靶点的抗癌治疗有可能成为肿瘤治疗的一个新的突破。,4、 NF -B途径在淋巴细胞恶 性肿瘤中的作用,（1）NF -B途径是白血病细胞增殖过程中的一个非常重要的途径 , 在 ALL和 ATL中 ,NF -B在免疫和炎症
13、反应中起重要作用 ,通过调节编码炎症因子基因和诱导酶 ,如诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)和环氧合酶 - 2(COX - 2)，NF-B也参与癌症的发生 ,发展和药物抵抗。 （2）NF -B的蛋白酶体抑制剂 PS - 341或 Bay11 - 7082可以抑制 NF -B从而抑制 ATL细胞的生长和诱导凋亡。,（3）在多发性骨髓瘤 (MM)中也有 NF -B的激活 ,通过 PS - 341对 NF -B的抑制和 NF -B的抑制剂 InBa的表达 ,它使MM细胞对传统的化疗药物如 (阿霉素 )更敏感。 （4）冬凌草素甲 ,一种天然的二萜化合物，通过抑制 NF-B和下调 Bcr- 2家族蛋白诱导
14、恶性淋巴细胞的生长抑制 ,促使细胞凋亡。 （5）NF -B是对 ATL和 MM等淋巴细胞恶 性肿瘤靶向治疗的一个靶点。,4、 NF B是维持LSC生存的要素,在维持LSC生存的要素中NF B和PI3k通路是很重要。在AML LSC中， NF B是持续激活的，抑制NF B的药物MG-132能诱导LSC凋亡，却不能影响正常HSC，因为正常HSC在没有丝裂原的刺激下， NF B是不激活的,（三） NF B及其他转录因子研究常用的一项方法-EMSA,凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA) : （EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和
15、其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实
16、验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。,Ets转录因子家族在肿瘤发生中的作用,Ets基因最早发现于美国Frederick的国家癌症研究所分子肿瘤学实验室.通过研究禽类逆转录病毒-E26，研究者发现了一系列拥有与E26高度保守的同源序列的基因，根据E26 (E-twenty six)的缩写而将该基因命名为Ets. 该基因的共同特点是含有高度保守的DNA结合域，能够和特定序列结合调控靶基因的表达和功能.通过调节细胞的增生、分化、凋亡及上皮-间充质间的相互作用,Ets参与许多生理和病理过程. 大量研究发现，Ets在哺乳动物的发育和肿瘤的侵袭转移中发挥重要的调控作用。,（一）Ets转录因子家族,人类Ets家族基因在进化上高度
