《《微生物学教学课件》第六章微生物生长繁殖》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《微生物学教学课件》第六章微生物生长繁殖（154页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第六章 微生物的生长及其控制,第一节 测定生长繁殖的方法 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长的主要因素 第四节 微生物培养法 第五节 有害微生物的控制 第六节 引起食品变质的微生物,第一节 测定生长繁殖的方法,一 测微生物生长量的方法 二 计微生物繁殖数的方法,一 测微生物生长量的方法： （一）直接法： 1 测体积（离心法） 2 测干重（离心法、过滤法）,（二）间接法： 1 比浊法：利用分光光度计或是浊度计测定微生物细胞的浓度 2 间接成分测定：测含氮量、含碳量、测遗传物质的量 3 生理指标法：呼吸强度、耗氧、酶活性、生物热等,原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比
2、，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,比 浊 法,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%；根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。,细胞成分测定,二 计微生物繁殖数的方法： （一）直接法（微生物总数,包括死菌在内） 1、比例计数法 2、血球计数板计数法,1 比例计数法,将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓
3、度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。 这种计数方法比较粗放。 需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。,2 血球计数板法,血球计数板的图示,原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。 适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,血球计数板法,（二）间接法（活菌
4、计数法） 1、液体稀释法 2、平板菌落计数法,10n,10n-2,10n-1,When we observe colonies, we cannot assume each arose from just one cell originally planted on the medium, however. A pair, chain or cluster of cells which land on the medium in close proximity to each other can multiply and produce a single colony. Thus, we us
5、e the term colony-forming unit when we consider the common origin for the cells of any colony.“ This term is usually abbreviated CFU.,Colony-Forming Unit,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,薄膜过滤计数法,第二节 微生物的生长规律,一 同步生长 二 典型生长曲线 三 微生物的连续培养 四 微生物
6、的高密度培养,一 同步生长：通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态。 获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。 选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,获得同步生长的方法：,二 典型生长曲线（群体生长曲线）（分批培养）,微生物典型生长曲线表示的是非丝状单细胞微生物在液体培养时的生长规律，广泛地应用于生产及研究上。,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长
7、曲线的制作,典型的生长曲线 （Growth curve）,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,细菌的同步生长与非同步生长的曲线,大肠杆菌生长实测生长曲线,一定量的微生物接种于装有一定体积培养基的装置中，进行一段时间的培养。期间，微生物数量的变化趋势？,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,延滞期：少量细胞接种到新培养基后的一段细胞数目不增加的适应期。其长短主要受微生物的接种龄、接种量和培养基成分的影响。,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,对数期：细胞数以几何级数增长的一段时期。其时间长短主要受菌株种类、营养成分和营养物质浓度的影响。,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,稳定期：
8、新繁殖的细胞数目与衰亡的细胞数目相等的一段时期。,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,衰亡期：细胞死亡数目超过新生的细胞数目的时期。死亡的细胞发生自溶。,上节回顾,工业上如何解除反馈抑制 微生物生长量的测定方法 微生物繁殖数的测定 典型生长曲线的适用范围 典型生长曲线的特征,1 生长曲线各时期的特点,1) 延滞期（lag phase）又称停滞期、适应期 细菌数目不增长的时期。 特点：生长速率常数等于零；细胞形态变大或增长；RNA尤其rRNA含量增加，合成代谢活跃；对外界不良条件敏感。,影响延滞期的因素： 接种龄；（对数期接种时，延滞期短；延滞期或稳定期，延滞期居中；衰亡期接种，延滞期延长） 接种量
9、（负相关） 培养基成分（营养丰富则延滞期短),2) 指数期（exponential phase）又称对数期,以几何级数速度分裂，细胞数目迅速增加的时期。 特点：生长速率常数R最大，则细胞每分裂一次所需要的代时G或原生质增加一倍所需时间最短；细胞进行平衡生长，各种组分最为均匀；酶系活跃，代谢旺盛。,繁殖代数：n（lgx2lgx1）/lg2=3.322(lgx2lgx1) 生长速率常数 Rn/(t2-t1)=3.322(lgx2lgx1) /(t2-t1) 代时（G）：G=1/R=(t2-t1)/ 3.322(lgx2lgx1),生长繁殖中的有关计算公式,影响指数期的因素： 菌种:生长周期长的微生
10、物,指数期则长； 营养成分：营养丰富则指数期短； 营养物浓度：限制性营养浓度大则指数期长； 概念：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物。又称生长限制因子 培养温度：最适温度时，指数期较短；,一些细菌的代时,菌名 培养基 培养温度 代时 E. coli（大肠杆菌） 肉汤 37 17min E. coli 牛奶 37 12.5 Enterobacter aerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶 37 1618 E. aerogenes 组合 37 2944 B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18 B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18
11、.3 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 6687 Streptococcus lactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26 S. lactis 乳糖肉汤 37 48 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 34446 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 79293 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200,3) 稳定期（stationary phase）,死亡细胞数目
12、和新增殖细胞数目平衡,即细胞数目基本不变的时期。平衡后期，曲线有下降趋势。 菌体产量与营养物貭的消耗间呈现一定的比例关系。,生长产量常数 Y（xx0）/(C0-C)=（xx0）/ C0 x：稳定期的细胞干重； x0：刚接种时的细胞干重； C0：限制性营养物的最初浓度,在稳定期，细胞开始贮存糖原、异染粒和脂肪等贮藏物，产芽孢，产次生代谢产物。 可通过补料、调节pH、调整温度等措施以延长稳定期累积更多的代谢产物。,4) 衰亡期（decline phase） 由于营养物质的进一步匮乏和代谢废物的累积，大量的微生物死亡、自溶，导致细胞数目急剧减少的时期。 细胞死亡后自溶释放出一些产物如：氨基酸、转化酶
13、、外肽酶、流出培养物。,微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：,初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；,次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。,2 微生物生长与代谢产物形成的关系,代谢产物和微生物细胞形成过程的关系 (a) 酵母菌形成的初级代谢产物乙醇； (b) 产黄青霉形成的次级代谢产物青霉素；,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养
14、基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。,可分为三个阶段： 1、生长停滞期 2、迅速生长期 3、衰退期,3 丝状微生物的群体生长,三 微生物的连续培养,连续培养是指向培养容器中连续流加新鲜培养液，使微生物的液体培养物长期维持稳定、高速生长状态的一种溢流培养技术，又称开放培养。,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,
15、连续培养原理,一）根据控制方式不同，连续培养分为： 1 恒浊器连续培养：控制微生物细胞的生长密度的一种连续培养形式 2 恒化器连续培养：通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的一种连续培养形式。,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。 特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,连续培养技术恒浊培养,使用范围：用于生产大量菌
16、体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,恒化器Chemostat 或bactogen,D=f(流速)/v(容积),恒浊器与恒化器的比较,二）按培养器级数分,单级连续培养器：适宜于代谢产物的产生速率与菌体生长速率相平衡的发酵，如乙醇发酵 多级连续培养器：适宜于生产的产物与菌体生长不平行的发酵，如丙酮或某些次生代谢产物的生产,三）连续培养与分批培养的比较 1 连续培养的优点： 高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多操作单元，从而减少了非生产时间； 便于自动控制 产品质量较稳定 节约了大量动力、人力、水和蒸汽等 2 连续培养的缺点： 菌种易变异； 易污染杂菌； 营养物的利用率一般低于单批培养,四 微生物的高密度培养,一）微生物的高密度培养一般指的是液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。 二）高密度培养的优点 提高菌体培养密度，提高产物的比生产率，不仅可减少培养容器的体积、培养基的
