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1、精品PPT课件 浏览免费 下载后可以编辑修改。 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ 读分享，下载后可以编辑修改。,基因操作的主要技术原理,核酸的凝胶电泳 扩增原理 分子杂交 测序,核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,同时也是分子生物学研究方法的技术基础。,基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链,依靠无反应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液,在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异,以及所带电荷的不同,可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,电泳的
2、迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子,比分子量较大的DNA分子迁移率要快;同等分子量的不同构型的核酸分子,构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快,凝胶电泳的分辨力: 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间,琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼脂糖。,LMP琼脂糖 熔点:6265 熔解后,在37 可保持液态数小时; 在25 可保持液态约10min,回收DNA分子 在65 下将LMP琼脂糖凝胶熔化; 加入过量的酚抽提DN
3、A; 离心获得含DNA分子的上清液; 直接酶切,琼脂糖凝胶电泳的参数: 缓冲液:1 TAE(TBE TPE) 凝胶的含量:根据检测的DNA大小 加DNA样品:1g,指示剂 电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短时间 染色和观察:溴化乙锭(ethidium bromide,EB)染色,在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪)。 能看到0.05 g的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比,Separation Range Vs. Agarose,Low Geling Agarose 4-6 0.02-0.4,用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算,Sample Well 25
4、 ng 1 kb ladder 0.8 Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,Agarose Gel Electrophoresis EtBr Detection Limit: 5-10 ng DNA,根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小,Agarose gel electrophoresis,Agarose gel electrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳 缓冲液:TBE 凝胶聚丙烯酰胺:丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺(29:1);TEMED和过硫酸铵( 10 )。,PolyAcrylamide Gels,脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 1984年,D.
5、R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角,下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角,由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比,分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。,在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角,下一个脉冲的电
6、场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角,由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比,分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 107bp的DNA大分子。,PFGE can resolve large DNA fragments,基因扩增(gene amplification) 主要内容: 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化,将目的基因在宿主细胞进行扩增 3.在环境作用
7、下,生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增,PCR技术 在1983年,美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,有称之为体外扩增法。,Reaction Condition for a Typical PCR Assay,Typical PCR Thermal Profile,This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous am
8、plification to achieve its full length,Some DNA Polymerases Used in PCR,Characteristics of Taq Polymerase,PCR引物: 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。 1.其长度通常在1530个核苷酸之间。 2.简并引物 atggctant 3.嵌套引物 PCR扩增的长度:2kb,PCR技术的应用: 1.基因组克隆 突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。,反相PCR(reverse PCR)与染色体步移,不对称PCR(asymmertric PCR) 用来制备单链
9、的DNA 特点: 两种引物的浓度不同,低浓度的限制引物和高浓度引物,两者浓度相差约100倍。 获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DAN链的特意洗脱。(生物素链霉素包裹的磁珠),上个世纪末,本世纪初，1996年,清华学界对中医气本质，经络实质，阴阳，五行，藏象，中医哲学观等都有了新的全面整体创造性的认识和解说。如，邓宇等发现的:气是流动着的信息能量物质的混合统一体；分形分维的经络解剖结构；数理阴阳；中医分形集：分形阴阳集阴阳集的分形分维数，五行分形集五行集的分维数；分形藏象五系统暨心系统、肝系统、脾系统、肺系统、肾系统；中医三个哲学观新提出的第三哲学观：相似观分形论等。 还包括近代针灸
10、经络的发展史,近代中医气的进展简史,中西医结合史,中医中药史等.在明朝（1368年1644），著名医学家李时珍的医学巨著本草纲目成书，这本书不仅是药物学专着，还包括植物学、动物学、（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）矿物学、化学等方面的知识。本草纲目刊行后很快传入日本、朝鲜及越南等亚洲地区，（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）在公元17、18世纪先后被翻译成多种欧洲语言。另一方面，李时珍是世界上第一个提出大脑负责精神感觉、又发现胆结石病、利用冰敷替高热病人降温以及发明消毒技术的医学家。此外还有王叔和的脉经、皇甫谧的针灸甲乙经、陶弘景
11、的本草经集注、葛洪的肘后备急方、巢元方的诸病源候论、苏敬的新修本草 （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）、王焘的外台秘要、元丹贡布的四部医典、太平圣惠方、王惟一的铜人腧穴针灸图经等大量医学典籍问世。自明朝中医发展已经达到了顶峰，（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）出现了诸多的医学流派。同时在朝鲜研究中医的（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）所谓东医学也得到了很大的发展，例如许浚撰写了东医宝鉴。 （df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 自清朝末年，中国受西方列强侵略，国运衰弱。同时现代医学（西医）大量涌入，严重
12、冲击了中医发展。中国出现许多人士主张医学现代化，中医学受到巨大的挑战。人们开始使用西方医学体系的思维模式加以检视，中医学陷入存与废的争论之中。同属中国医学体系的日本汉方医学、韩国的韩医学亦是如此。2003年“非典”（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）以来，经方中医开始有复苏迹象。（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr） 在文化大革命期间，中医作为“古为今用”的医学实例得到中国共产党政策上的支持而得以发展。现代，中医在中国仍然是治疗疾病的常用手段之一。（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 近代、现代医学史 近代的医
13、学（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh） 西方近代医学是指文艺复兴以后逐渐兴起的医学，一般包括16世纪、17世纪、18世纪和19世纪的欧洲医学。 16世纪 封建社会后期，手工业和商业发展，手工工厂出现，生产力的增长也促进对新市场的寻找。1492年哥伦布发现新大陆,1497年达伽马发现好望角,15191522年麦哲伦环绕世界一周。（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）许多药物（如鸦片、樟脑、松香），由东方传入欧洲，美洲发现后，欧洲也有了金鸡纳、愈创木、可可果。 （df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 由于资本主义的兴起，首先在意大利形成了资产阶级的知识
14、分子。他们的特点是敢于向教会思想挑战，反对宗教迷信的束缚。他们的口号是：（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2） “我是人，人的一切我应该了解”，以此来反对神学的统治。他们一方面传播新文化,一方面竭力钻研和模仿古代希腊的文化,因此此时期称为“文艺复兴”。1543年哥白尼出版天体运行论，是科学史上文艺复兴的开始。 （45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）医学革命。文艺复兴运动中，怀疑教条、反对权威之风兴起。于是，医界也产生了一场以帕拉切尔苏斯(14931541) （df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）为代表的医学革命。 （4f肿瘤
15、fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 中世纪的医学校中,主要讲阿维森纳的医典,以及加伦和希波克拉底的著作。教师照本宣科，一切墨守成规，毫无生气。文艺复兴的狂潮，很快就波及医学领域。帕拉切尔苏斯指出人体的生命过程是化学过程。他在巴塞尔大学任教时主张用流行的德语写书和讲演，使医学易为大众所接受，这是一件伟大的改革。他重视实践，反对烦琐的经院哲学，反对中世纪顽固的传统和权威观念，他说：“没有科学和经验，谁也不能成为医生。（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）我的著作不是引证古代权威的著作，而是靠最大的教师经验写成的”。他勇敢地向墨守成规和盲目崇拜进行斗争，公开焚毁了加伦和阿维森纳的著作。 人体解剖学的建立。古代的人认为身体是灵魂寄居之处,在封建社会,各民族无例外地禁止解剖尸体。（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）因此,人体解剖学得不到发展,这个时代的医书如加伦所著的解剖学中，解剖图几乎全是根据动物内脏绘成的。反之，文艺复兴时代的文化，把人作为注意的中心，在医学领域内人们首先重视的就是研究人体的构造。（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh） 首先革新解剖学的是意大利的达芬奇，他认为作为现实主义的画家，（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球
