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1、2019/1/16,1,第六节：蛋白质的性质,2019/1/16,2,一、蛋白质性质： 胶体性质(p299) 两性性质及等电点 (p291) 蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固 (p233,300) 蛋白质的紫外吸收 蛋白质的分子量 (p291) 蛋白质的呈色反应,二、蛋白质含量测定法 (p315),2019/1/16,3,蛋白质分子量大，它在水溶液中所形成的颗粒直径约为1100nm。 胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等。 利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可以对蛋白质进行纯化，这是提纯蛋白质的一种常用方法。,(一)胶体性质,2019/1/16,4,在溶液中
2、能形成稳定的胶体的因素,极性不电离基团： 形成水化层,极性电离基团： 形成双电子层,原 因,2019/1/16,5,(二)两性性质及等电点,Isoelectric point (pI)定义： 在某一pH值溶液中，Pr酸性基团和碱性基团的解离程度相当, Pr分子所带正负电荷相等，净电荷为零,在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值称为该蛋白质的pI。,pHpI 净电荷为负,pHpI 净电荷为正,2019/1/16,6,蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质。在蛋白质分子中，可解离基团除了肽链末端的-氨基和-羧基外，主要的还是肽链上氨基酸残基的一些侧链基团， 如： NH2、COOH、-COOH
3、、咪唑基、胍基、OH等。,2019/1/16,7,2019/1/16,8,pH=pI时，净电荷为零，在电场中不移动 pHpI时，净电荷为负，在电场中向阳极移动 pHpI时，净电荷为正，在电场中向阴极移动 在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀.,2019/1/16,9,（三）蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固,2.复性,1.变性,3.沉淀和凝固,定义,变性因素,变性实质,变性蛋白质的特点,变性的分类,定义,沉淀类型,2019/1/16,10,吴宪教授1931年：“天然Pr分子借助次级键连接而成一种紧密，有规则的空间结构，变性作用使次级键破
4、坏从而使结构松散”。,1. 蛋白质的变性(denaturation),(1)定义：在某些理化因素的作用下，蛋白质严格的空间结构（不包括肽键）被破坏，从而引起若干理化性质改变和生物学功能丧失的现象。,2019/1/16,11,变性 因素,2019/1/16,12,变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、MW不变）。,2019/1/16,13,变性蛋白 质 的特点,2019/1/16,14,变性 分类,可逆变性: Pr变性后如将变性剂除去，该Pr分子的天然构象和生物学 活性还能恢复，这一过程称为复性（renaturation）,不可逆变性：若变性条件强烈，作用时间长，构像变化大，理化
5、性质难以恢复。,举例：医疗；生物制品保存；生活等。 应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老,2019/1/16,15,HOCH2CH2SH,Urea,Guanidine HCl,Mercaptoethanol,Cl-,SDS,SO4- -(CH2)11CH3,常見的蛋白质变性剂,Juang RH (2004) BCbasics,2019/1/16,16,极性头部,非极性尾巴,SDS 是一种表面活性剂,sodium dodecyl sulfate,Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.275,2019/1/16,17,SDS 在蛋白质表面均勻铺上一层负电荷,SDS
6、,变性蛋白質成一线狀分子,自然状态蛋白质,並且均勻帶上一层负电荷,Juang RH (2004) BCbasics,2019/1/16,18,2019/1/16,19,核糖核酸酶变性与复性作用,Native ribonuclease,Denative reduced ribonuclease,Native ribonuclease,变性,复性,2019/1/16,20,去除变性因素后，变性蛋白恢复原来的空间结构，恢复生物活性的现象。 本质一级结构决定高级结构,2.复性（renaturation）,2019/1/16,21,变性蛋白质为什么能复性？,在一定的环境条件下，蛋白质的一级结构能够决定二
7、、三、四级结构。变性蛋白质的二、三、四级结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍然保持不变，因此除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象。,2019/1/16,22,加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固（coagulation）。 因此，凝固的蛋白质一定发生变性。,Whats coagulation of protein?,2019/1/16,23,凝固：变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀(但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质) ，加热等因素使蛋白质变性并凝聚成块状。,总结：Pr变性、沉淀与凝固之间的关系 变性Pr不一定沉
8、淀 沉淀Pr不一定变性 变性Pr不一定凝固 凝固的Pr一定变性,3. 沉淀与凝固,沉淀：蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称沉淀。,2019/1/16,24,沉淀类型 PI法 盐析法 有机溶剂沉淀法 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱、有机酸试剂沉淀蛋白质 加热变性沉淀法 抗体对蛋白质的沉淀：,2019/1/16,25,机理：夺取蛋白质颗粒上的水化膜， 降低溶液的介电常数,2019/1/16,26,蛋白质胶体颗粒的等电点沉淀,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,酸,酸,碱,碱,脱水,脱水,脱水,不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）,带正电荷的蛋白质 （疏水胶体）,带负电荷的蛋白质 （疏水
9、胶体）,碱,酸,（亲水胶体）,（亲水胶体）,（亲水胶体）,2019/1/16,27,不可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀,2019/1/16,28,可逆沉淀,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白
10、质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,2019/1/16,29,定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。 原理:破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层 中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。 半饱和硫酸铵沉淀球Pr 饱和硫酸铵沉淀清Pr 优点：Pr不变性，常用。,盐析法（Salting out)(p305),2019/1/16,30,蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多H2O，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀。,盐析（NH4）2SO4）,2019/1/16,31,2019/1/16,32,大部分蛋白质
11、均含有带共轭双键的Tyr、Phe和Trp。这三种AA在280nm 附近有特征性吸收峰。在此波长范围，蛋白质的A280与其浓度成正比。利用这个性质，可以对蛋白质进行定量测定。 此外，蛋白质的肽键在215nm、225nm亦有紫外吸收，可以用于蛋白质浓度的测定,(四）蛋白质的紫外吸收,2019/1/16,33,（五） 蛋白质的分子量,蛋白质的相对分子量,蛋白质相对分子量在10 0001 000 000d之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,2019/1/16,34,测定蛋白质分子相对质量的方法,1.根据化学组成测定最低相对分子质量,2.渗透压法：,3.沉
12、降法：超速离心,4.凝胶过滤法：,5.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：,2019/1/16,35,1.根据分子组成测定最小分子量,测定某一微量元素或某一氨基酸的含量如铁原子或色氨酸，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子或一个色氨酸，即最低相对分子质量=铁的原子量/铁的百分含量,牛血清白蛋白含Trp 0.58% 最低M=35200d，实际为69000d，含2个Trp,2019/1/16,36,2 .据pr的渗透压测 蛋白质分子量,2019/1/16,37,用一半透膜将pr溶液与纯水隔开，当渗透压达平衡时，测定其渗透压，计算分子量：,C：浓度（克/升） R：气体常数（0.082升/大气压/克分子/K开氏温
13、度） T：绝对温度（开氏温度） ：以大气压表示的渗透压,2019/1/16,38,优点： 渗透压法简单、准确(10000-100000d)、且不受蛋白质分子的形状和水化程度影响 不足： 但受pH的影响，不能区别溶液中蛋白质分子是否均一 .,2019/1/16,39,3、 葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量 p297,2019/1/16,40,标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体），分子形状为线型或与凝胶发生吸附的蛋白质不可用此法测定。,2019/1/16,41,4.SDSPAGE （十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳）,2019/1/16,42,加入SD
14、S和少量巯基乙醇，则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量，而与电荷和分子形状无关。 影响迁移率的主要因素 凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产 生不同的阻力主要因素 凝胶的浓度和交联度 同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离的测量误差） 此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量,2019/1/16,43,（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,2019/1/16
15、,44,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。,通电,2019/1/16,45,沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。,v =沉降速度（dx/dt） =离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,沉降系数的单位常用S，1 S=110-13（s）,超离心法是最准确可靠的确定蛋白质分子量方法。（Svedberg 于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。,3 .超离心法,2019/1/16,46,蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系,2019/1/16,47,反应 试剂 颜色 反应基团 有此反应的Pr及AA 双缩脲反应 NaOH,稀CuSO4 紫或粉 2个以上肽键 所有蛋白质 Millon反应 Millon,硝酸，亚硝酸 红色 酚基 Tyr 黄色反应 HNO3及NH3 黄、橘黄 苯基 Phe,Tyr 乙醛酸反应 乙醛酸H2SO4 紫红 吲哚 Trp 坂口反应 次氯酸钠,萘酚 红色 胍基 Arg Folin酚试剂反应 CuSO4磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基 Tyr 茚三酮反应 茚三酮 紫蓝色 游离氨、羧基 Pro和羟Pro呈黄色,（六）蛋白质
