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1、第6章 微生物的生长及其控制,第1节 测定生长繁殖的方法 第2节 微生物的生长规律 第3节 影响微生物生长的主要因素 第4节 微生物培养法概论 第5节 有害微生物的控制,微生物不论在自然条件下还是在人为条件下 发生作用，都需要达到一定的数量才能实现。 微生物生长的定义是指微生物个体数目的增 加，即繁殖。 微生物死亡的定义是指细胞永久失去繁殖的能力。,第1节 测定生长繁殖的方法 一、测生长量 （一）直接法 测细胞干重 测细胞湿重 （二）间接法 比浊法 测生理指标,二、计个体数 （一）直接法 用计数板在光学显微镜下直接观察并计数。,荧光染料染色： 活菌为绿色，死菌为红色,（二）间接计数法 比法浊
2、平板菌落计数法 （1）浇注平板法（pour plate） （2）涂布平板法（spread plate） 厌氧菌的菌落计数 滚管培养法（教材P168）,第2节 微生物的生长规律 一、微生物的个体生长和同步生长 研究单细胞微生物的个体生长很困难。 1、同步培养（synchronous culture）： 使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同 样的细胞生长和分裂周期的培养方法。 2、同步生长（ synchronous growth）： 某细胞群体中所有个体细胞处于分裂步调一致 的生长状态。,获得同步生长的方法 （1）环境条件诱导法 （2）机械筛选法,膜洗脱法,薄膜洗脱法收集的大肠杆菌在葡萄糖基础
3、培养基中的同步生长。,二、单细胞微生物的典型生长曲线（同步，封闭）,单细胞微生物的典型生长曲线,（一）延滞期（lag phase） 培养开始最初细胞数目没有增加的一段时期。 特点： 生长速率常数为零，但合成代谢十分活跃。 细胞形态变大或增长。 细胞内RNA（尤其是rRNA）含量增高。 对外界不良条件反应敏感。,生长速率常数（R）：单位时间内细胞数目或细胞量的变化。,影响延滞期长短的主要因素 （1）菌种 生长快的菌比生长缓慢的菌延滞期短。 （2）接种菌菌龄 采用对数生长期的菌作为接种菌可缩短延滞期。 （3）接种量 适当提高接种量可缩短延滞期。 （4）培养基成分 营养丰富，与种子培养条件接近的培养
4、基可缩 短延滞期。,（二）指数期（对数生长期）（exponential phase） 紧接延滞期后细胞数目以几何级数增长的一段时期。 特点： 生长速率常数R最大，代时G最短。 细胞进行平衡生长。 酶系活跃，代谢旺盛。,代时（G）：1个细胞分裂为2个所需要的时间。,影响指数期微生物代时长短的主要因素： 菌种 原核比真核短，小的真核比大的真核短。 营养成分 营养物浓度 生长限制因子（growth-limited facter） 4. 培养温度（教材表6-1）,（三）稳定期（stationary phase） 是在对数生长之后细胞群体进入的生长与死亡处于 动态平衡的一段时期。 特点： 生长速率常数R
5、=0 菌体产量达到最高 某些细胞开始启动一些特殊的代谢途径: 形成芽孢，形成贮存颗粒，形成次级代谢产物。,稳定期到来的原因： 营养物质的耗尽。 营养物比例失调。 有害代谢产物的积累。 pH、氧化还原势等条件越来越不适宜。,（四）衰亡期（decline phase,death phase） 整个群体生长速率R为负值的时期。 特点： 个体死亡速度超过新生速度，R为负值。 细胞形态发生多形化。 细胞开始自溶。 产生衰亡期的主要原因： 环境对继续生长越来越不利。,三、微生物的连续培养 连续培养的目的 长时间地保持微生物的对数生长状态以提高经 济效益。 连续培养的方式 恒浊器 恒化器,单级 多级,单级
6、多级,连续培养的利弊 利：高效节约，自控，产品质量稳定 弊：菌种易退化，易污染，营养物利用率低于单 批培养。 4. 连续培养时间是有限制的,四、微生物的高密度培养 自学教材P159-160,第3节 影响微生物生长的主要因素,影响微生物生长的因素很多，但主要的因素 有4个：水分、温度、氧气和pH值。,一、水分对微生物生长的影响 水活度 水活度（water activity，aw）：它表示在天然或人 工环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的 含量。 aw =,P P0,（教材P 93）,农业土壤中的aw一般在0.91之间。,生长最低 aw,细菌,一般：0.900.98 嗜盐菌：0.75（约5.
7、5M NaCl）,酵母菌,一般：0.870.91 高渗酵母：0.610.65 鲁氏酵母：0.60,霉菌,一般：0.800.87 耐旱菌：0.650.75 双孢旱霉：0.60,调剂溶质（compatible solutes） 生活在水活度低（渗透压高）的环境中的微生物 如何获得水分（细胞处于正态水平衡positive water balance）？ 靠提高细胞内部溶质的浓度： （1）泵入无机离子 （2）合成或提高某种有机溶质的浓度（直接合成 或从环境中积累）。,用来调节细胞内水活度或溶质浓度的溶质叫 调剂溶质（compatible solutes）。它必须不阻碍 细胞内其他生化过程。 细胞内调剂
8、溶质的浓度取决于外部溶质浓度。 每种生物合成或积累调剂溶质的最大量是由每种 生物的基因决定的一种特性。这决定了不同的生 物对水活度的不同耐受性。,微生物的调剂溶质 微生物 积累的主要溶质 生长最低aw,细菌 甜菜碱，脯氨酸（G+） 0.97-0.90 淡水蓝藻 蔗糖，海藻糖 0.98 海水蓝藻 -葡萄糖基甘油 0.92 盐湖蓝藻 甜菜碱 0.90-0.75 嗜盐厌氧 甜菜碱，ectoine， 海藻糖 0.90-0.75 光合细菌 极端嗜盐古菌 KCl 0.75 和一些细菌,微生物的调剂溶质 微生物 积累的主要溶质 生长最低aw,海洋藻类 甘露醇，各种糖苷， 0.92 脯氨酸，二甲基巯基丙酸 杜
9、氏藻 甘油 0.75 (嗜盐绿藻) 耐干旱酵母 甘油 0.83-0.62 耐旱丝状真菌 甘油 0.72-0.61,杜氏藻 : Dunaliella,微生物中几种主要 的有机调剂溶质,甜菜碱,海藻糖,蔗糖,甘油,甘露醇,二甲基巯基丙酸,二、温度对微生物生长的影响 微生物生长的三个温度常数温度三基点 最低生长温度（minimum temperature） 最适生长温度（optimum temperature） 最高生长温度（maximum temperature） 三基点对于每种微生物一般是其特有的，但又不 完全固定，它们能被其他的环境因子轻微地改变， 尤其是生长的培养基质对基本温度的影响大。,最
10、低生长温度：在此温度下，生长不会发生。 细胞膜不能保持流动状态，影响营养物质的 运输和质子动力的形成。 最高生长温度：超过这一温度，不可能生长。 高温使一些分子失活，细胞膜破裂。 最适生长温度：生长最快。,微生物生长的温度范围 根据微生物的最适温度可将它们划分为4大群： （1）嗜冷菌（psychrophiles） Topt15 永久寒冷的地区。 （2）嗜温菌（mesophiles） Topt 45 温血动物，热带与温带土壤、水域。 （3）嗜热菌（thermophiles） 很热的环境中：堆肥。 Topt 45 （4）超嗜热菌（hyperthermophiles） Topt80 极端热的环境：火
11、山口，硫磺热泉，自燃煤堆。,Growth rate,3. 嗜冷菌冷适应的分子机理 酶在冷的条件下能发挥最佳功能。 膜中含有较高浓度的不饱和脂肪酸 4. 嗜热菌热适应的分子机理 酶和其他蛋白质对热的稳定性更高，在高温有最 好的功能（增加盐桥、大量的疏水内核）。 细胞内特殊的溶质（环2,3-二磷酸甘油）。 细胞内存在大量的分子伴侣。 膜中含饱和脂肪酸、植烷和醚形成的单层膜。,三、氧气对微生物生长的影响 1. 按照微生物与氧的关系，可将它们分为2大类： 好氧微生物（aerobes） 厌氧微生物（anaerobes） 2大类又可进一步分为5类： 专性好氧（obligate or strict aero
12、bes） 兼性厌氧（facultative anaerobes） 微好氧（microaerophilic bacteria） 耐氧菌（aerotolerant anaerobes） 专性厌氧菌（obligate anaerobes）,好氧,厌氧,5类细菌在 含有巯基乙醇的培养基中的生长和分布。,氧的毒性形式的产生和消除 羟自由基（OH） 超氧化物（O2- ） 单一态氧（ O2） 过氧化氢（H2O2）,在呼吸过程中O2还原成H2O中产生的不可逆副产物,氧的毒性形式：,（1）过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2） O2氧化黄素蛋白无一例外地要产生一种有毒的 化合物H2O2,O2+
13、e- +H+ H2O2,FP,H2O2+H2O2 2H2O+O2,Catalase,H2O2+NADH+H+ 2H2O+NAD+,Peroxidase,过氧化氢酶,过氧化物酶,（2）超氧化物（superoxide， O2- ） 由H2O2的氧化作用以及其他酶（黄素蛋白，Q，铁硫蛋白）催化的氧化作用或加氧作用产生。 2 O2- +2H+ O2+H2O2,超氧化物岐化酶（SOD）,2 H2O2 2H2O+O2,过氧化氢酶（catalase）,O2+ e- O2-,FP，FeS, Q 等,（3）羟自由基（hydroyl radical， OH ） 由离子辐射产生，少量的羟自由基可由于细胞 内H2O2
14、的积累而产生： H2O2+e-+H+ H2O+OH,（4）单一态氧（singlet oxygen，O2） 能量很高，外围电子高度活化。 产生方式： 光化学反应（细胞含光敏色素P）： P+hv P* P*+O2 O2 生物化学反应：各种过氧化物酶。 类胡萝卜素能淬灭单一态氧。,小结： 毒性氧形式的产生 O2+e- O2- O2- + e- +2H+ H2O2 H2O2+ e- + H+ OH OH+ e- + H+ H2O,O2+光+光敏色素 过氧化物酶,O2,有毒氧的消除： 超过氧化物岐化酶酶 superoxide dismutase 2 O2- +2H+ O2+H2O2 过氧化氢酶 catalase H2O2+H2O2 2H2O+O2 过氧化物酶 peroxidase H2O2+NADH+H+ 2H2O+NAD+ 类胡萝卜素 淬灭单一态氧,四、pH值对微生物生长的影响 每一种生物都有一生长的pH值范围，一般有相 当固定的最佳pH值。 绝大多数自然环境的pH 值在59之间。 只有少数生物能在低于2或高于10的pH中生长。,真菌 最适pH5 细菌 最适pH一般为中性 6.07.5 放线菌 最适pH 7.08.0,专性嗜酸菌（obligate acidophilic bacteria） 在pH 2.04.0 生长，但
