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1、滤纸条降解试验吸取纤维素降解菌种子液 1ml 接种到装有 50ml 赫奇逊培养液的 250ml 三角瓶中，瓶中放置 1cm6cm 的新华号滤纸条，同时设置不加菌液的滤纸条作为对照，每个处理 3 个重复。 置于 30恒温摇床，200r/min 振荡培养 5d，观察各瓶中滤纸条溃烂情况。赫奇逊培养液：KH 2PO4 1.0g MgSO47H2O 0.3g CaCl2 0.1g NaCl 0.1gFeCl3 0.01g NaNO3 2.5g pH7.27.3 蒸馏水 1000ml纤维素酶活的测定1 CMC 酶活测定取培养好的发酵液于 4000r/min 的条件下离心 15 分钟，上清液即为粗酶液。分
2、别加入相对应菌株的粗酶液 1mL，加入柠檬酸缓冲液 1ml，再加入 0.8%的羧甲基纤维素钠溶液 1.5mL，震荡摇匀，将所有试管置于 50的水浴锅中保温50min，保温完成后取出试管，加入 2mL DNS 显色剂，震荡摇匀，将各试管置于沸水浴中水浴加热 5min，使 DNS 显色剂与还原糖充分反应，5min 后取出试管用流水冷却，再用蒸馏水定容至 20mL，将各试管摇匀后以葡萄糖标准曲线1 号管作为对照，依次测定各菌株在紫外分光光度计 540nm 处的 OD 值，计算出平均值后，参照葡萄糖标准曲线查出还原糖的量。2 FPA 酶活测定取培养好的发酵液于 4000r/min 的条件下离心 15
3、分钟，上清液即为粗酶液。分别加入相对应菌株的粗酶液 1mL，加入柠檬酸缓冲液 1ml，再加入滤纸(1cm 6cm) 一条，震荡摇匀，将所有试管置于 50 的水浴锅中保温 50min，保温完成后取出试管，加入 2mL DNS 显色剂，震荡摇匀，将各试管置于沸水浴中水浴加热 5min，使 DNS 显色剂与还原糖充分反应， 5min 后取出试管用流水冷却，再用蒸馏水定容至 20mL，将各试管摇匀后以葡萄糖标准曲线 1 号管作为对照，依次测定各菌株在紫外分光光度计 540nm 处的 OD 值，计算出平均值后，参照葡萄糖标准曲线查出还原糖的量。3 Avicel cellulase (Avicelase)
4、500 uL of enzyme mixed with 1mL of Avicel (1%, w/v) for determining the Avicelase activity. 详细见给你的那篇文献通过以上两种方法，测得复筛得到的酶活高的菌株每 8 h 的粗酶酶活产酶曲线，测到 72h。确定酶活达到最大的最适时间。产酶条件优化研究不用培养温度、pH 值、碳源、氮源、接种量、装液量对菌株产酶的影响，并在各因子最适条件下培养菌株，检测其产酶酶活。(培养的时间均为酶活达到最大的最适时间)培养时间：生长曲线和产酶曲线1 培养温度对产酶的影响。将复筛得到的酶活高的菌株分别接种于 5 个 100 m
5、L 的羧甲基纤维素培养基中（用 250mL 的三角瓶承装） ，并分别在 25、 30、 35、40、 45下培养，培养一定时间后，测定其 CMC 酶活，从而确定菌株产酶的最适温度。2 培养起始 pH 对产酶的影响。将复筛得到的酶活高的菌株分别接种于 5 个 100 mL 羧甲基纤维素培养基中，并将其起始 pH 值分别调至 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。培养一定时间后，测定其 CMC 酶活，从而确定菌株产酶的最适 pH 值。3 不同碳源对产酶的影响。分别以 CMC-Na、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、麦麸、乳糖为碳源代替基础培养基中
6、的碳源，添加量均为 10g/L ，培养纤维素降解菌。培养一定时间后，测定其 CMC 酶活，从而确定菌株产酶的最适碳源。然后添加不同浓度(20g/L、30g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L)的最适碳源代替基础培养基中的碳源，培养纤维素降解菌。培养一定时间后，测定其 CMC 酶活，从而确定菌株产酶的最适碳源的最适浓度。4 不同氮源对产酶的影响。分别以胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、NH 4 NO3、(NH 4)2SO4、NH 4Cl、KNO 3、NaNO 3、尿素、大豆为氮源代替基础培养基中的氮源，添加量均为 2g/L，培养菌株。培养一定时间后，测定其 CMC
7、 酶活，从而确定菌株产酶的最适氮源。然后添加不同浓度(1 g/L、3g/L、5g/L、7g/L、 9g/L、12g/L) 的最适氮源代替基础培养基中的氮源，培养纤维素降解菌。培养一定时间后，测定其 CMC 酶活，从而确定菌株产酶的最适氮源的最适浓度。5 不同接种量对产酶的影响。将复筛得到的酶活高的菌株分别以不同的接种量(1%、2、4 、6、8 、10)接种于 5 个 100 mL 的羧甲基纤维素培养基中， 培养一定时间后，测定其 CMC 酶活，从而确定菌株产酶的最适接种量。6 不同装液量对产酶的影响。25mL/250mL、50mL/250mL、80mL/250mL 、100mL/250mL、1
8、50mL/250mL在最适条件下培养菌株根据以上结果，配制以最适碳源，氮源的培养基，最适起始 pH 值并在最适温度的条件下培养最适时间，测其酶活，做 3 个平行试验，取平均值。注：培养基配方羧甲基纤维素培养基：羧甲基纤维素钠 10g、蛋白胨 10 g、Yeast extract（酵母浸粉） 10 g、NaCl 5 g、K 2HPO4 1 g、MgSO 47H2O 0. 2 g、CaCl 2 0.3 g，FeSO 47H2O 5 mg，M nSO4 1.6 m g，ZnCl 2 1.7 m g，CoCl 2 2 mg，pH 调至 7. 2。基础培养基：NaCl 5 g、K 2HPO4 1 g、M
9、gSO 47H2O 0.2 g、CaCl 2 0.3 g，FeSO 47H2O 5 mg，M nSO4 1.6 mg，ZnCl 2 1.7 mg，CoCl 2 2 mg，pH 调至7.2。酶（CMCase）特性研究（见英文文献）酶的特性研究 1）pH 值2）温度3）不同 pH 值对酶稳定性影响4）不同温度（热稳定性）对酶稳定性影响5）金属离子酶活性的影响1 酶催化反应的最适条件1.1 温度对酶活力的影响将 CMCase 测定中的水浴温度分别设为 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80，分别测定测 CMCase 和 FPase，以最高酶活值为 100%，得到并比较这两种
10、酶处在不同温度的酶促反应中的相对酶活力，从而确定其最适酶促反应温度。1.2 pH 对酶活力的影响分别配制 pH 值为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的柠檬酸缓冲液用于稀释粗酶液，然后用不同 pH 值的柠檬酸缓冲液分别配制浓度为 1%的 CMC-Na 溶液，分别测定 CMCase 和 FPase，以最高酶活值为 100%，获得并比较两种酶在不同 pH 酶促反应中的相对酶活力，最后确定最适酶促反应 pH 值。2 酶的稳定性研究2.1 酶的热稳定性研究将稀释后的粗酶液分别置于 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80的
11、水浴中恒温处理 lh 后，在 最适酶促反应条件下测定不同温度处理后的 CMCase 和 FPase 剩余酶活力，以未做特殊处理的粗酶液作对照，评价两种酶的热稳定性。2.2 酶的 pH 稳定性研究配制 pH 值为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的柠檬酸缓冲液，分别加入粗酶液，在 4下放置 2h 后，在最适酶促反应条件下测定剩余酶活力，以未用缓冲液处理的粗酶液的酶活力为对照，评价两种酶的pH 稳定性。3 金属离子对酶活力的影响用最适 pH 值的缓冲溶液配制终浓度为 l0-3mol/L 的Fe2+、 Mg2+、Pb 2+、Ca 2+、Cu 2+、Zn 2+、Co 2+、Na +、Mn 2+和 K+的离子溶液，并对粗酶液进行稀释，在最适酶促反应条件下测定 CMCase 与 FPase，把不加任何金属离子的具有相同的稀释倍数的粗酶液作为对照组，研究金属离子对CMCase 与 FPase 的影响。
