ch6-细胞重组与克隆动物

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1、细胞重组与克隆动物,第六章,一.细胞重组 二.细胞核移植 三.克隆动物,一、细胞重组 1.细胞拆合 细胞拆合即细胞组分的分离与融合，是指将细胞分为核和质两部分，还包括微细胞的诱导和中期染色体的分离。 诱导核质分离和产生微细胞需用特殊的试剂松胞素B。 松胞素B又称细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)。是一种真菌的代谢产物。1967年发现CB可以诱导离体培养的小鼠L细胞去核。,2.细胞组分的分离 胞质体（cytoplast）指去核后的细胞。能保持细胞的原形，具有除核以外的细胞器，不能合成DNA和RNA，但能合成蛋白质。 核体（karyoplast）或称小细胞（minicells），指

2、细胞分离出来的核。外包有质膜和少量细胞质，在一段时间内能合成DNA和RNA。 微细胞（micocells）秋水仙素将细胞分裂阻滞在中期，细胞不能分裂，一条或几条染色体组装成为微核，再用松胞素处理，微核突出细胞膜外，可获得微细胞。,3.细胞重组方式 细胞质杂种(cybrib)由胞质体与完整细胞融合而成。 胞质体带有氯霉素抗性（CAPR）的小鼠L细胞的胞质体。 完整细胞对氯霉素敏感（CAPS）、但具有BudR抗性（BudRR ）的小鼠L细胞亚系。 胞质杂种可以在具有氯霉素和BudR的培养基中存活。,图6-1 胞质杂种的产生, 微细胞异核体(micocell heterokaryons)由微细胞与完

3、整细胞融合而成。 微细胞只含有单个或几个染色体，是进行遗传物质转移的适宜工具。 微细胞异核体经分裂也是体细胞杂种，是研究基因定位、基因表达的好材料。,图6-2 微细胞的形成（一）,图6-3 微细胞的形成（二）, 重组细胞(reconstituted cell)用一种细胞的胞质体与另一种细胞的核体融合而产生。 重组细胞的鉴定方法： 放射性同位素标记法 用3H-TdR标记细胞核供体，用3H-Leu标记细胞质供体。 融合细胞作放射自显影，如果胞质和胞核都有放射性银颗粒，而核的颗粒大而深、胞质银粒较细，即为重组细胞。,图6-4 同位素标记法鉴定重组细胞, 综合标记法 用大乳胶颗粒标记胞供体（HPRT-

4、）,去核后得胞质体（去核细胞）； 用小乳胶颗粒标记核供（HPRT）,得小细胞（核体）； 胞质体（大乳胶颗粒）与小细胞融合成重组细胞； 胞质体（大乳胶颗粒）与核供体细胞（小乳胶颗粒、HPRT）融合成胞质杂种。,图6-5 重组细胞与胞质杂种的鉴别,二、细胞核移植 在细胞重组的几种方式中，胞质体与核体的重组，即核移植技术(nuclear transplantation)最令人关注。 1.鱼类和两栖类的核移植 1938年，德国胚胎学家汉斯.施佩曼（Haus Speman）提出：“在两栖动物中，8细胞以前的胚胎具有发育的全能性”的观点。并提出奇异的设想：把一个细胞的细胞核取出，然后把取自另一个发育到后期

5、的胚胎的细胞核放入这个卵细胞中。,1952年，美国学者罗伯特.布里格斯（Robert Briggs）等，将豹蛙发育到囊胚期的胚胎细胞做移植试验，成功获得可摄食的豹蛙幼体。 1958年，英国学者约翰.格登(John Gurdon)等，利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培养出可育的爪蟾。 1961年，我国学者童第周等进行鱼类不同亚科间细胞核移植获得成功。,表6-1 移核后卵子发育的实验,1978年，童第周等将黑斑蛙成体红细胞的细胞核移入去核的未受精卵内，卵子正常发育成蝌蚪（红细胞这样高度分化的细胞，在特殊条件下，也可重新表达）。 1979年，武汉水生所，将鲫鱼囊胚期细胞经过385天59世代连续继代培养

6、后，再将此培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。1984年，培养出两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常，80多天长到8cm 。 1989年，童第周等将鲫鱼胚胎细胞核移入去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，无性繁殖出“鲤鲫核鱼”。,2.哺乳类的细胞核移植 两栖类实验材料具有卵数量多、容易取得、体积较大、操作方便等优点，而哺乳动物的卵细胞直径小，鼠卵直径为100m、兔卵125m、牛卵140m、人卵100m 。核移植需在显微操作仪(micromanipulator)下进行。 1977年，美国杰克逊实验室的 “亚无性繁殖” 实验 （1）受精卵在精、卵核融合前把精核去掉，放入松胞素溶液中；

7、 （2）上述处理后卵细胞染色体的复制出现两个核，将此双核卵放入正常的培养基中培养；,（3）卵中双核自动融合，并开始细胞分裂； （4）将此胚胎移入母鼠子宫培养； （5）生产出7只单亲小鼠。 1981年，瑞士的卡尔.伊尔门泽(K.Illmensee)等首次获得小鼠卵核移植成功。 他们将囊胚内细胞团的核移入去核的受精卵中，经培养，移植卵发育至囊胚期，再将此胚胎植入同步孕鼠的子宫内，产下两雌一雄小鼠。,（1）纯系(LT/SV或CBA/HT-6)灰色小鼠作核供体亲本； （2）第四天，从雌鼠中收集胚泡，去透明带，使内细胞团(ICM)与滋胚层（TE）分离； （3）在酶的作用下，ICM和TE分散为单个细胞；

8、（4）用微细管把单细胞中带一层细胞质的核，移入刚刚受精的黑色纯系（C57BL/6）核受体亲鼠的受精卵中； （5）将黑鼠受精卵中原来的雌、雄两核吸出； （6）将接受核移植的胚胎在体外试管中培养4天至囊胚期； （7）把胚胎与白色(ICR/Swiss或BALB/C)纯系对照组鼠胚胎一起植入ICR/Swiss的白色假孕母鼠的子宫中发育； （8）产下3只灰色小鼠（21）。毛色、核型、葡萄糖磷酸同功酶均为核供体表型。,图6-6 小鼠核移植试验,其后两年，很多学者都不能重复上述试验，甚至有人怀疑研究成果是伪造的。有学者认为，来源于4细胞期或更后期的细胞核就不再具有发育成胚胎的能力。实验的失败，使很多人一度放

9、弃了克隆动物的研究。,三、克隆动物 1.细胞全能性与克隆 （1）细胞全能性 细胞全能性(cell totipotency)是指已经分化了的和尚未分化的细胞具有发育成完整有机体的潜在能力。 细胞全能性与细胞机能的特化是相互矛盾的，细胞全能性的一个结果是使它的机能发展受到限制，而细胞机能的特化必须以其特定的物质结构和数量为前提。 细胞要么保持“全能”，使各种机能的发展局限在维持的水平上；细胞要么“特化”，大大提高某种机能的效率。二者必取其一，难以两全其美。单细胞生物选择前者，高等生物选择后者。,（2）克隆的内涵及延伸 clone,cloning,根据我国遗传学家吴旻的建议，音译为克隆。clone是

10、指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群。在不发生突变的情况下，它们的遗传结构是相同的。 cloning指克隆方式产生克隆群体的过程或手段。 克隆原作名词的内涵是指无性繁殖群，外延作动词是指无性繁殖的操作过程。如，把克隆；外延作形容词形容无性繁殖的产物。如，克隆羊。 现在习惯上把DNA分子、基因片段、单克隆抗体的复制也认为是克隆。 1977年，世界卫生组织将克隆定义为遗传上同一的机体或细胞系（株）的无性生殖。,2 哺乳动物的克隆方法 （1）胚胎分割法 将未着床的早期胚胎采用显微手术分为若干等份，将每一块分割物植入受体而妊娠产仔。这样，一个胚胎就可克隆出多个遗传相同的个体

11、。 二等份胚胎分割法成功的有：小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、马、牛等； 四等份胚胎分割法成功的有：小鼠、绵羊、牛等； 严格意义上，此法不是真正的克隆，只能算是“多胚胎复制”。,（2）胚胎细胞核移植法 将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流作用下，单个细胞与去除染色体的未受精的成熟卵母细胞融合，发育成胚胎后，移入受体妊娠产仔。 此法成功克隆的动物有：小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛、猴等。 有关的实验说明：哺乳动物的胚胎细胞在分裂成8细胞前均为全能细胞，每个分裂球的基因均能全部表达。理论上，每个卵裂球经过核移植都能发育成遗传相同的个体。,（3）胚胎干细胞核移植法 胚胎干细胞(embryonic s

12、tem cell , ES )是从早期胚胎内细胞团(ICM)分离出来的、能在体外培养的一种高度未分化的多能细胞。 胚胎干细胞是含正常二倍染色体、具有发育全能性的细胞。突出的特点是能在体外培养，并能以克隆形式保存。 目前，仅有小鼠分离克隆出其胚胎干细胞并成克隆出成体。牛、猪、羊兔已分离克隆出胚胎干细胞，但未成功克隆后代。,（4）胎儿成纤维细胞核移植法 从妊娠早期胎儿中分离出胎儿成纤维细胞，采用核移植法克隆出胚胎，再移入受体妊娠产仔。 （5）体细胞核移植法,3、体细胞核移植法 （1）绵羊克隆成功 1997年2月23日，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司宣布，胚胎学家伊恩维尔穆特(Ian Wi

13、lmut)博士领导的4人研究小组，于1996年7月无性繁殖了一只雌性小绵羊多利。被美国科学杂志评为1997年首项世界十大科技成就。 （2）克隆绵羊过程 取芬兰多塞特(Finn Doret)白品种6岁母绵羊的乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法”使其进入休眠状态而全部基因均有活性。, 給苏格兰黑面母绵羊Sottish Blackface注射促性腺激素Gn，以促使其排卵，取未受精卵快速去核，用“饥饿法”使其进入G0期作受体细胞。 核供体乳腺细胞注射Gn34-36小时后与无核卵放入同一培养皿中，在微电流作用下，乳腺细胞融入卵，成为一个含有新遗传物质的卵细胞。 新卵细胞植入羊结扎的输卵管内，6天后发育成桑

14、椹期后囊胚期（8-16个细胞），在植入假孕母羊子宫内。 产下白色的“多利”羊。,图6-7 克隆羊过程,（3）克隆的成功率 从434个细胞取出遗传物质植入卵细胞中，产生277个融合细胞（成功率为63.8%）； 融合细胞移入母羊输卵管，成功247个（成功率89.2%）； 发育至桑椹期的胚胎只有29枚（成功率11.7%）； 植入13只母羊子宫后，仅有1头怀胎（成功率7.7%） 从一个体细胞孕育出一只后代山羊，总的成功率为0.23%。,（4）关键技术饥饿法 正当伊尔门泽进行的哺乳动物核移植试验在困难的停滞时期，马萨诸塞大学年仅29岁的基恩坎贝尔博士坚定地认为：“如果能在青蛙的试验中做得到的，那么，在哺

15、乳动物中也能做得到”。并认为，哺乳动物卵子之所以不吸收或不利用细胞核的遗传物质，是由于它们的细胞周期不同步，核供体和核受体细胞处在细胞周期的不同阶段上。 坎贝尔建议采用减慢细胞活动的方法，迫使供体细胞处于某种休眠状态，以期获得与受体细胞的同步状态，便于二者结合。这就是后来的“饥饿法”。 维尔穆特就是采用“饥饿法”减慢生长速度使二者进入G0期，同步后便于融合。,（5）实验的验证、重复和发展 1998年1月31日，美国和意大利两位科学家在科学杂志上发表文章，对维尔穆特用于克隆的供体多塞特母羊提出质疑，并对“多利”诞生一年后没有一例重复实验提出质疑。 1998年2月，罗斯林研究所和PPL公司决定邀请美国科学家对“多利”进行遗传基因检验。1998年7月，美国科学家宣布，“多利”的真实性是可靠的，乳腺细胞没有错。 1998年7月，美国檀香山大学的若山辉彦及其导师柳町隆藏宣布，他们已从成年鼠细胞中克隆出三代鼠50只。此法用棕色鼠卵丘细胞细胞核注入黑鼠去核卵细胞中，化学方法将卵子激活，移植至白色雌鼠的子宫内，产下褐色鼠。接着，又对克隆鼠进行克隆，三代共50只。, 1998年7月23日，PPL公司又宣布，一只带有人体蛋白基因的小羊克隆成功，从该转基因山羊奶中提取出胞外超氧化物氧化酶。 1998年9月，“多利”经与威尔士山羊交配自然怀胎，生下一只健康的小羊，