目标序列捕获技术综述

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1、靶基因靶基因分离分离技术技术与新一代测序技术的完美组合与新一代测序技术的完美组合 吴仁花 深圳华大基因研究院 摘要摘要： 以 Ilumina 的 solexa, AB BIOMERIEUX 的 SOLID 以及 Roche 的 454 为代表的新一 代测序技术出现，不仅大大提高了测序的通量和精确度，还使测序成本降低了 100 倍，但整 个基因组例如人或其它大的基因组重测序成本依然是巨大的， 因此分离靶基因进行测序成为 进行大量重测序的首选。 而靶基因的分离已成为基因重测序发展的瓶颈， 除了对传统的 PCR 分离基因技术的改进，近两年涌现出一些新的基因分离技术：基于杂交和 DNA 分子微阵列 技

2、术的 MGS(microarray-based genomic selection)技术；以 MIP（molecular inversion probe） 和 PCR 原理为基础的 gen-coleteor， selector，Agilent 的液相杂交技术和 SMART（Spacer multiplex amplification reaction）等新的基因捕获技术。这些基因分离技术和新一代高通量测 序技术的结合将大大降低测序成本， 从而推动遗传学及基因组学的发展， 并在人类基因测序 成本降低到 1000 美元之前成为不可替代的手段。 近年来测序技术突飞猛进的发展， Illumina 的

3、solexa, AB BIOMERIEUX 的 SOLID 以 及 Roche 的 454 等新一代测序技术，不仅快速，高通量，高精确度，以及成本低(2)。但是 全基因组的测序费用仍是庞大的，目前人的全基因组测序成本仍在 200000 美元以上（2） ， 要达到人的基因组测序成本 1000 美元，还需要几年时间。因此分离目的基因进行测序成为 人们研究目标基因变异的重要手段(2,3)。 近两年来，人们在致力于靶基因分离技术的研究，除了有传统的 PCR 方法外，提出了 一些新的方法， 如基于杂交和 DNA 微阵列技术的 MGS(microarray-based genomic selection)

4、， 以 MIP（molecular inversion probe）和 PCR 原理为基础的 gen-coleteor， selector，Agilent 的液相分离技术， SMART（Spacer multiplex amplification reaction）技术等（3-12） 。 1.1 传统的传统的 PCR 分离基因方法分离基因方法 传统的 PCR 方法，首先根据目标 DNA 序列设计特异性引物，利用特异引物进行 PCR 反应扩增靶基因， 再用 Sanger 法对扩增产物测序 （4,5） 。 这种方法适用于小范围的基因分离， 及 Sanger 法测序，而对于大的基因区域则无能为力了。

5、例如，要分离 100k 的 DNA ，则至 少需要 2000 个 500bp 的 PCR 反应，至少要设计 4000 条引物。成本和人力都是一般实验室 无法承受的。尽管人们将多对引物混在进行 PCR 反应，但混合 PCR 会导致更多的非特异扩 增及扩增效率降低，为后续的测序工作到来麻烦。而且 PCR 分离基因的方法适合于 Sanger 测序，而对高通量的新一代测序系统，因此人们开始寻求其他方法。 1.2 MGS(microarray-based genomic selection)基于基于杂交和杂交和 DNA 微阵列技术的基因分离微阵列技术的基因分离 方法方法 MGS(microarray-b

6、ased genomicselection)基因分离方法是 Roche NimbleGen 于 2007 年（6-8）发表的一种利用 DNA 微阵列和杂交技术方法，可以从复杂的真核生物基因组中分 离特定基因。2008 年 4 月份首先将此技术商品化，目前 NimbleGen 已对外提供 385000 芯 片和 HD2.1 芯片，385000 芯片铺有 385000 探针，可以分离得到 5M 的碱基；HD2.1 芯片铺 有 2100000 探针，可以分离到得到 30M 的碱基。NimbleGen 探针长度为 50-92bp 之间。 NimbleGen 分离靶基因的基本的步骤包括（图 1） ： （

7、一）物理方法剪切基因组 DNA 得到平 均大小为 300bp 随机片段， （二）DNA 片段末端修复并加上接头， （三）DNA 片段与芯片 上带有的寡核苷酸探针杂 （四）洗脱芯片上探针捕获的目的 DNA 片段（五）利用接头引 物对捕获的 DNA 片段进行扩增。 Albert 等 （7） 用 NimbleGen 的 385,000 芯片分离人类基因组 5M 的外显子， 并用 454 FLX 测序仪对分离到的外显子测序，发现有 65%以上的 reads（75%，65%，77%）能比对到靶基 因序列，靶序列的平均富集度为 432 倍。单个碱基的平均覆盖率为 5，7，7。Hodges 等(8) 用 7

8、 个 385000(共 44M)芯片分离人类全基因组的 204490 个外显子 （7） ， 分离产物经 Illumina 1G 测序系统测序，得到 4.2million 个 reads， 其中 53.7%为外显子，基因组外显子的碱基 覆盖率为 25.04% （表 1） ， 靶序列平均富集 237 倍 （8） 。 若将测序 reads 延长到 300bp， 500bp 则外显子碱基覆盖率可达到 60%（8） 。而对于 NimbleGen 的 HD2.1 芯片的分离效果还未有 报道。 图 1 基于 DNA 微阵列技术的基因分离示意图（引自 Okou，2007） 表 1 Hodges 等用 MGS

9、发分离人类基因组外显子测序结果 Exons reads Reads in exons exons with reads(%) Bases covered(%) Sequncing coverage(%) 204,490 4,198,280 1,993,201 53.7 25.04 1.19 MGS 方法操作比较简单，基因分离过程无需特殊酶反应，较为稳定，富集靶序列的均 一度较好，一次可分离到大量（30M）的靶基因。但这种方法也有其缺陷：首先每个样品需 要一张芯片，虽然 NimbleGen 声称芯片可以重复用一次（7） ，但以免前一次所杂交的污染， 最好不要重复使用；且此方法的操作需要专门的杂交

10、仪器和洗脱仪， 因此成本较高。其次， 其要求DNA 样品的起始量为20g, 因此不适用于对于较为稀少的样品或石蜡包埋的易降解 的样品。最后，此种方耗时较长，杂交的部分就需要 64-72h, 整个过程大概需要一周。最后 因为探针的介质是芯片，因此其分离基因数量的升级受到芯片面积的限制。 1.3selectors Dahl 等在 2005 年（9）提出利用特异性寡聚核苷酸结构和 PCR 扩增，进行分离靶基因。 其基本工作原理如图 2 所示。selector 包括两个寡聚核苷酸结构：一条两端带有与靶基因侧 翼序列互补的寡核苷酸 selector 探针，一个普通的载体寡聚核苷酸序列。首先用特定的核酸

11、限制性内切酶将 DNA 消化成片段， 然后变性后与 selector 进行孵育杂交，使目标 DNA 序列 与 selector 上的探针退火， DNA 连接酶将靶基因两端与载体核苷酸序列相连， 从而使靶基因 片段环化并消化线性 DNA。最后利用通用引物对环化的靶基因进行扩增。 Dahl等利用selector方法分离96个基因片断， 并成功分离到80%的基因片段 （9） 。 selector 方法采用环化的方法筛选靶基因片段较之传统的 PCR 方法更能避免非特异性扩增，而且用 通用引物进行靶基因的扩增，使得多个 PCR 合为一个反应，从而减少了酶等的用量，降低 了成本。但此方法的探针较为复杂，且

12、需要选用合适的核酸限制性内切酶消化 DNA 样品， 因此 selector 技术要用于分离大量靶序列还有待完善。 图 2 selector 方法分离靶基因的工作原理（引自 Dahl，2005） 1.4 gene-collector gene-collector 技术是 Fredriksson 等 2007 年提出的，以 PCR 为基础，在 PCR 之后加入 与一段两端分别与 PCR 特异引物对互补的寡聚核苷酸即 collector probe，从而分离靶基因的 方法（图 3） 。gene-collector 方法的原理如图 3 所示，正确扩增的 DNA 片断通过其两端与 Collector p

13、robe 互补杂交形成环并在 DNA 连接酶的作用下环化，而非特异扩增的线性 PCR 产物则被核酸酶消化。 环化的靶基因片段在随机引物和DNA聚合酶的存在下进行滚环扩增。 Fredriksson(10)等设计了 170 对引物运用 gene-collector 技术成功分离到了 10 个癌基因的所 有编码序列。其随机克隆检测结果显示 58%的序列可以比对到靶基因，用 Affymetrix 重测 序芯片检测 90%以上的目标序列得到扩增。 gene-collector 方法在传统的 PCR 基础上加入 collector probe，筛选正确扩增的 DNA 片 段，不仅大大减少非特异扩增，而且减

14、少了非特异扩增的对正确扩增的竞争性抑制，使目标 序列能更好的扩增。多个 PCR 反应混在一起，不仅降低了成本还减少了 DNA 样品的用量。 gene-collector 类似于 selector 技术，但它不需要限制性内切酶的消化 DNA 样品，collector probe 也要比 selector probe 简单，但仍然需要合成大量的引物和特异探针。 图 3 gene-collector 的工作原理示意图（引自 Fredriksson,2007） 图 4 Agilent 的液相基因分离技术工作原理（引自 Porreca，2007） 1.5 Agilent 的液相的液相分离分离技术技术 2

15、007 年 Porreca（11）等发表了一种以 padlock 和 MIP 技术原理为基础的分离基因的 方法（图 4） 。次种方法的基本步骤为（1）利用 70nt（两端与靶序列侧翼互补 20nt 的寡核 苷酸序列探针由 30nt 通用 linker 相连）的寡核苷酸探针与基因组 DNA 进行杂交， （2）缺口 补平并连接成环，再利用核酸外切酶消化线性 DNA， （3）以和通用 linker 互补的引物进行 滚环扩增和线性扩增来富集靶序列，（4） 再利用通用 linker 将富集目标序列环化， 利用 hRCA 形成大分子序列， 随机打断成短 DNA 片段， 加上接头， 形成 Shotgun 文

16、库， 进行测序。 Porreca （11）等设计 55000 个寡核苷酸探针，利用该方法进行两次平行的基因分离，Sanger 测序的 结果显示 98%的序列可以比对到目标序列上，而 shotgun 文库测序的结果显示两次实验中各 分别有 49%，62%的序列可以比对到靶标序列（表 2） ，而都只有 20%即约 10000 个靶序列 被捕获（表 3） ；两次共分离到 15380 个靶序列。分离的靶基因片段为 60-190bp。 Agilent 的液相基因分离方法有较高的特异性；操作也较简单；无需特别的仪器设备， 只需在 96 孔板就可以进行；成本较低，耗时少，只需几个小时；而且需要的 DNA 样品起 始量低，只需 0.5g。但此种方法分离基因具有偏好性，且分离片段大都在 200bp 以下。 Porreca （2） 等推测其分离基因的偏好性可能与序列的 G+C 含量及靶序列的长度有关。 Agilent 要将这种方法商业化，还需进一步完善。 表 2 Agilent 的液相基因分离测序结果 reads captured reads captured reads/reads