《论小麦高分子量谷蛋白14亚基（hmw-gs14）基因的原核表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《论小麦高分子量谷蛋白14亚基（hmw-gs14）基因的原核表达（35页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、,科技大学 届毕业论文（设计） 题目：论小麦高分子量谷蛋白14亚基 （HMW-GS14）基因的原核表达 姓 名： 专 业： 生物技术 指导老师： 院 （系）： 生命科学学院 完 成 日 期：,小麦高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14） 基因的原核表达,摘要 关键词 前言 材料与方法 结果与分析 讨论 结论 参考文献 致谢,摘要,用限制性内切酶 EcoR和Sal双酶切pMDHMW,回收长约2.2kb的高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因，将其亚克隆到表达载体pET-30a(+)的相应位点上，构建了该基因的原核表达载体pET-HMW 。SDS-PAGE分析结果显示，经IPTG诱导，高
2、分子量谷蛋白14亚基(HMW-GS14)基因在大肠杆 Rosetta(DE3)pLysS中得到了表达。,Abstract,After slicing the pMD-HMW with two restriction endonucleases EcoRand Sal,recollect the high molecular weight glutenin subunit 14(HMW-GS14) gene which is about 2.2kb in length, then subclone it into the relative site of the expression vecto
3、r pET-30a(+),and eventually the prokaryotic expression vector pET-HMW is constructed . The analysis result of SDS-PAGE shows that after induction of IPTG, the high molecular weight glutenin subunit 14 (HMW-GS14) gene is expressed in the E.coli Rosetta(DE3)pLysS,关键词,高分子量谷蛋白14亚基基因 原核表达 亚克隆,Keywords,HM
4、W-GS14 gene prokaryotic expression subclone,前言,小麦是最重要、种植面积最广的粮食作物之一。由于高产量新品种的选育推广、耕作栽培技术的提高及农业投入的增加，我国小麦产量不断提高，数量上暂时告别短缺。然而，随着社会饮食业、旅游业的发展和人民生活水平的提高，以小麦面粉为原料的各种精致面食和方便食品、保健食品及营养食品的生产增长很快，使得全国各地对小麦特别是优质小麦的需求，呈现不断增长的势头，并对小麦的品质提出了更高的要求。,小麦的加工品质与小麦种子中麦谷蛋白及醇溶蛋白的含量和组成关系极为密切，高分子量麦谷蛋白与加工品质之间的关系已通过遗传、分子结构分析、
5、显微电镜等方法得以阐明。在不同高分子量麦谷蛋白亚基对加工品质的贡献的研究中,发现5+10亚基为优质亚基，而2+12亚基为劣质亚基。然而我国的一些优质小麦品种如小偃6号（亚基组成为1，14+15，2+12）等缺乏5+10，而且具有被认为是劣质的2+12亚基。分析结果表明，导致其优质的原因在于其所具有的14+15亚基，14+15亚基具有5+10亚基的功能 。因此，研究14+15亚基功能对于从分子水平上改良小麦品质具有重要意义。,本研究拟在以前的工作基础上，构建高分子量谷蛋白14亚基（HMW-GS14）基因的原核表达载体，并实现其在大肠杆菌表达宿主菌株Rosetta(DE3)pLysS中的特异表达，
6、为进一步纯化HMW-GS14及研究其功能、性质奠定基础。,材料与方法,（一）材料 （二）方法,（一）材料,1.菌株和质粒： 大肠杆菌JM109菌株、 Rosetta(DE3)pLysS菌株、含HMW-GS14基因的重组质粒pMD-HMW以及原核表达载体pET30a(+)均为本实验室提供。 2.酶与试剂：限制性内切酶EcoR和Sal购自大连宝生物工程有限公司，凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司，T4DNA ligase购自Promega公司，其他酶与试剂均为本实验室常规储备。,（二）方法,1. pMD-HMW的提取 2. pMD-HMW的酶切鉴定 3. 连接反应 4. 感受态细胞的制备
7、5. 转化 6. 菌落PCR 7. 重组表达质粒pET-HMW的提取与酶切鉴定 8. 重组表达质粒pET-HMW转化表达宿主菌 9. 诱导表达及SDS-PAGE分析,1. pMD-HMW的提取,挑取含有重组质粒pMD-HMW的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中（含氨卞青霉素 100ug/ml）,于37，180rpm振摇培养1214h。 含有原核表达载体pET-30a(+)的单菌落（卡那霉素 50ug/ml）做相同处理。 然后按照“SDS碱裂解法”小量制备质粒pMD-HMW和pET30a（+）。,2. pMD-HMW的酶切鉴定,用限制性内切酶 EcoR和Sal双酶切重组质粒pMD-HMW。在
8、20ul酶切体系中，加入10ul pMD-HMW、2ul 10buffer、1ul EcoR、1ul Sal和6ul ddH2O。置于37水浴中,酶切23h。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。,3. 连接反应,重组质粒pMD-HMW用限制性内切酶 EcoR和Sal双酶切处理，回收HMW-GS14基因（长约2.2kb），同时原核表达载体pET-30a(+)也用EcoR和Sal双酶切处理。将酶切处理后的pET-30a(+)和回收的HMW-GS14基因进行连接。20ul连接反应体系：ddH2O 4ul、目的基因片断 10ul、原核表达载体 3ul、10buffer 2ul、T4DNA ligase 1
9、ul。于16，过夜连接。连接产物可以暂存于-40备用。,4.感受态细胞的制备,挑取大肠杆菌JM109单菌落，接种于5ml LB液体培养基中；37，180rpm,振摇培养1214h；吸取1ml过夜菌液, 转入50ml新鲜LB液体培养基中扩大培养，条件同上；约23个小时（OD值约为0.4左右）后，将菌液转移到冰预冷的50ml聚丙烯管中，冰浴10min，使细胞冷却至0；4，4100rpm，离心10min，弃上清，并尽可能吸干；用10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀；4，4100rpm，离心10min，弃尽上清；最后，用2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2 （含15%的甘油），
10、重悬沉淀。 将制备的感受态细胞分装至1.5ml的微量离心管中，每管200ul。-80保存，也可以直接用于转化。大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS菌株做同样处理，制备感受态细胞。,5.转化,吸取5ul连接反应产物，加入到含200ul JM109感受态细胞的微量离心管中，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30min；42，热激90sec（勿摇动离心管）后，立即将管转入冰浴，使细胞冷却12min；加入800ul LB液体培养基， 37，180rpm，振摇培养1h，使菌复苏；吸取适当体积（80ul）的已转化细胞，均匀地涂布到LB固体培养基上（含卡那霉素 50ug/ml）；37，倒置培养1214h。,6
11、. 菌落PCR,从5.步涂布的平板上，随即挑取数个或数十个单菌落，将其一部分进行菌落PCR，以筛选阳性克隆；对应部分转印至新的平板上（含卡那霉素 50ug/ml），37，倒置培养1216h。 在10ul总反应体积中，加入ddH2O 7ul、10buffer 1ul、引物P014和P024各0.3ul（浓度为0.5 mmol/L）、甘油1ul以及Taq DNA聚合酶0.4ul（1U），进行PCR扩增。PCR程序为：95预变性5min、95变性50sec、55退火50sec、72延伸30sec、72延伸10min、4 forever。共25个循环。1.0琼脂糖凝胶电泳观察记录结果，筛选出阳性克隆（
12、含重组表达质粒pET-HMW）。,7.重组表达质粒pET-HMW的提取 与酶切鉴定,同步骤2.小量制备重组表达质粒pET-HMW做EcoR和Sal双酶切处理，1.0琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。,8.重组表达质粒pET-HMW转化 表达宿主菌,将鉴定好的重组表达质粒转化Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞，操作方法如5.所述。将适当体积的已转化细胞均匀地涂布在平板上（含卡那霉素 50ug/ml、氨卞青霉素 25ug/ml），37，倒置培养1214h。,9.诱导表达及SDS-PAGE分析,挑取含重组表达质粒pET-HMW的阳性单克隆，接种于5ml LB液体培养基中（含Kan 50ug/m
13、l、Cm 25ug/ml），于37，180rpm振摇培养1214h；按1：100稀释加入到5ml LB液体培养基中（含Kan 50ug/ml、Cm 25ug/ml）；振摇培养至OD600值为0.5左右，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L；继续于37振摇培养45h。 12000rpm，离心30sec,收集菌体；加入1SDS loading buffer【50mM TrisCl(pH6.8)、100mM DTT、2SDS、0.1溴酚兰、10甘油】重悬沉淀；煮沸10min，12000rpm，离心5min，取上清，置于4备用。将诱导产物经SDS-PAGE（凝胶配置如表1）分析，用考马斯亮蓝R25
14、0染色6h左右；然后，先用高甲醇脱色液脱色12h，再用低甲醇脱色液脱色至背景清晰为止。,表1 聚丙烯酰胺凝胶制备,返回,结果与分析,（一）重组质粒pMDHMW的酶切鉴定 （二）菌落PCR （三）重组表达质粒pET-HMW的双酶切鉴定 （四）表达产物的SDS-PAGE分析,（一）重组质粒pMDHMW的酶切鉴定,重组质粒pMDHMW经EcoR和Sal双酶切处理后，进行1琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒pMDHMW理论上应切出两条带，分别为HMW-GS14基因（长约2.2kb）以及空克隆载体pMD18（长约2.7kb）。,（二）菌落PCR,EcoR和Sal双酶切处理后的pET-30a(+)和回收的HMW
15、-GS14基因进行连接。连接产物转化大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)pLysS 后，用引物P014、P024进行菌落PCR。阳性克隆能扩增出长约400bp的片段。,（三）重组表达质粒pET-HMW的双酶切鉴定,重组表达质粒pET-HMW理论上应切出两条带，分别为HMW-GS14基因（长约2.2kb）和空载体pET30a (+)（长约5.4kb）。,（四）表达产物的SDS-PAGE分析,将重组表达载体pET-HMW转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,并进行诱导表达。取15ul上样，SDS-PAGE后，考马斯亮蓝R250染色结果表明：经IPTG诱导，含有重组表达质粒pET-H
16、MW的菌株可特异地产生一条与HMW-GS14分子量相当的蛋白条带。取诱导的空载体pET30a (+)和未诱导的pET-HMW做对照；小偃6号做Marker，含14亚基。,返回,讨 论,大肠杆菌表达宿主菌株Rosetta(DE3)pLysS是T7 RNA聚合酶/启动子表达系统。其染色体上，带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因,这类菌株能配合pET载体一起表达。pLysS是带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。Rosetta(DE3)pLysS菌株在被诱导前，T7 RNA聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使重组体（表达外源蛋白，可能会影响宿主细胞的生长和活力）在宿主中更稳定。,pET系列载体是含有T7噬菌体启动子的表达载体。在这类载体中，外源基因的表达是受T7噬菌体RNA聚合酶调控的，这类载体是Studier等于1
