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1、实验三,基因的PCR扩增技术,一、实验目的,学习PCR反应的基本原理与实验技术 从BCG基因组DNA中PCR扩增Rv1791（PE19）基因,二、基本原理,PCR类似于DNA的天然复制过程。 将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两段寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n倍。,体内DNA的复制,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5
2、,3,3,变性、退火,变性、退火,总体积 25-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,1 反应体系,三、实验材料,BCG基因组DNA 10PCR反应缓冲液、4dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物 （P1、P2）、超纯水SW PCR反应管、移液器、 PCR仪、离心机,四、实验步骤,引物设计 准备PCR反应溶液 PCR扩增反应 结果检测,Rv1791-F： ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC（EcoR I） Rv1791-R： ATCTCGAGTGTTCCCCCTCTCCTTCAG （Xh
3、oI）,（二）准备PCR反应溶液,10PCR反应缓冲液 2.5l 4dNTPs 2.0l 引物P1 1l（10nM） 引物P2 1l 模板DNA 2l Taq DNA聚合酶 0.2l 用无菌去离子水至 25l 用手指轻弹PCR反应管管底部，使溶液混匀 在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底,在PCR仪中设计如下反应程序：94C、5min；94C、30sec，61C、40sec，72C、30sec，30个循环；72C、5min,（三）PCR扩增反应,将已混匀的PCR反应管置于PCR仪的反应孔中，盖好盖子,进行反应。反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用,（四）结果检测,本PCR扩增的产物DNA片段长度为300bp，适合于在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。从每个反应管中取5ul PCR产物进行电泳检测。,五、思考题,影响PCR结果的因素。,
