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1、第六章蛋白质工程原理及其在食品加工中的应用,第一节 蛋白质工程的原理和方法,以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。,一、蛋白质工程的概念,天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，它既能高效地发挥功能，又便于机体的正常调控，因而极易失活而中止作用。但在生物体外，特别是工业化的粗放生产条件下，这种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质的极不稳定性，导致难以持续发挥应有的功能，成为限制其推广应用的主要原因。如温度、压力、机械力、重
2、金属、有机溶剂、氧化剂以及极端pH值等都会影响它的作用。 蛋白质工程技术针对这一现状，对天然蛋白质进行改造改良或全新设计模拟，使目的蛋白质具有特殊的结构和性质，能够抵御外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下也能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔的应用前景。,主要包括：分子遗传学、蛋白质结构功能相关的理论与技术。 分子遗传学：完整cDNA的克隆技术、DNA序列的快速测定技术、DNA序列推测蛋白质序列的多维程序系统、原核生物及真核生物基因表达过程的调控、基因的定位诱变及随机诱变理论与技术等。 蛋白质结构功能分析：蛋白质一级结构氨基酸序列的分析；X光单晶衍射结构分析技术；两维和三维核磁共振结构分析技
3、术；蛋白质结构数据库的建立；蛋白质功能的酶学和免疫研究技术；蛋白质分子力场、能态、自由能等生物物理学研究技术；计算机模拟处理结构分析系统等。,两大类理论与技术相互关联、相互促进，借助其他多类学科的支持，完成对蛋白质分子结构与功能分析、归类，进一步展开突变蛋白质的分子模拟与预测，实现蛋白质的改造，以及全新蛋白质的分子结构与功能的设计，在计算机模拟的基础上，进行蛋白质分子的化学修饰、合成的实际操作，验证分子设计的结果，获得具有特定结构、性质和功能的目的蛋白质。,二、蛋白质工程的原理,（一）蛋白质工程的目的 对目的蛋白质进行结构和功能上的设计与改造，以满足人们特定条件下的需要。以蛋白质结构与功能的研
4、究为基础，掌握蛋白质活性中心的结构，包括催化中心和调节中心的空间构象，了解构成中心的各氨基酸残基及其侧链基团的位置，再借助计算机图像与处理系统的模拟进行分子辅助设计，提出对目的蛋白质的改建或构建方案，确定活性中心的氨基酸残基组成，并辅助设计和预测其结构功能的变化。,（二）蛋白质工程的组成部分 1.蛋白质放大扩增系统 由组织提取的少量纯化的蛋白质，通常只有0.1-1.0mg。作为出发蛋白质分子，先解析部分肽段的一级结构，根据遗传密码设计并合成相应的同位素标记寡聚核苷酸片段，再由此从基因文库中调出该蛋白质的克隆化基因，转入DNA序列分析系统测定DNA序列并克隆化，最后通过表达载体系统扩增蛋白质的量
5、，达到能够分析出发蛋白质的结构功能的水平，通常需要蛋白质量为0.1-1.0g。,2.蛋白质结构功能分析及分子设计系统 由上一系统获得足量的出发蛋白质后，通过目前已经具备的蛋白质结构分析方法，分析蛋白质的一级结构和空间结构。X光衍射分析晶体蛋白质的结构，而三维核磁共振法研究溶液中的蛋白质结构，同时研究该蛋白质结构与功能的关系，并将结果输入计算机图像处理系统和结构处理系统，根据生物物理学原理以及已知蛋白质结构功能数据库的基本规律，从结构与功能研究出发，进行分子结构分析与模拟，进一步辅助设计和功能预测，提出分子的预期性质、改造或构建方案，完成突变蛋白质的分子设计或构建过程。,3.突变蛋白质的合成表达
6、系统 将突变方案通过分子遗传学方法实施即蛋白质的定点突变技术，改造或构建方案通过合成突变寡聚核苷酸，引入定位突变，或采用其他方法引入突变，并进入克隆系统分离出突变DNA，以此作为模板，引入载体表达系统，扩增表达获得大量的突变蛋白质。对获得的突变蛋白质进行结构、性质和功能的分析、测试与判定，如符合分子设计的要求，则获得目的蛋白质；如不能满足实际要求，则再由分子设计系统重新指导设计，进入新一轮循环，最终获得满足人们要求的目的蛋白质。,（三）蛋白质工程操作中的问题 1.有关分子遗传学和基因工程的问题 例如更有效的cDNA克隆技术，精确高效的定位突变技术，高效目的基因表达系统等。 2.有关蛋白质结构功
7、能研究的理论和技术 例如准确地由一级结构推测高级结构，肽链折叠的精确控制，蛋白质的翻译后修饰，蛋白质结构可变性，分子动力学与蛋白质功能的关系，蛋白质在晶体、溶液以及细胞中的不同存在状态及其对蛋白质性质、功能的影响等。 3.一些相关辅助技术 例如微量蛋白质的纯化鉴定技术、更有效的蛋白质结晶方法、计算机辅助系统的有效性等。,三、蛋白质工程的基本步骤,1.分离纯化目的蛋白，使之结晶并作X晶体衍射分析，结合核磁共振技术等其他方法的分析结果，得到其空间结果尽可能多的信息。 2.对目的蛋白质功能作详细的研究，确定它的功能域。 3.通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间相互关系的分析，找出关键的基团和结
8、构。 4.围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法实施。 5.对经过改造的蛋白质进行功能测定，看看改造的效果如何。 6.重复4和5两个步骤，直到获得理想的结果。,四、蛋白质工程的主要研究方法,1.蛋白质的分离纯化鉴定方法、结构分析方法、功能研究方法和进行结构改造的分子生物学研究方法 在这四类根据蛋白质工程的操作步骤而划分的主要研究方法中，蛋白质分离纯化鉴定方法与生物化学中的常规方法没有本质的区别，是对许多结构、性质相似的一系列突变蛋白质的分离、纯化和鉴定，但其难度要大得多，通常需要运用多种高精度的方法才能实现，如亲和层析、等电聚焦、免疫沉淀等。,2.蛋白质功能研究
9、方法必须根据不同种类的蛋白质所具有的不同功能，相应地采用不同的研究方法 如对具有催化活性的蛋白质酶，则用酶学的稳态动力学方法；对抗体则用免疫学方法；其他蛋白质如激素、生长因子、受体类以及核酸结合类蛋白质都有相应的研究方法。所有这些蛋白质功能的研究中，建立一套高效、简便的蛋白质功能测定方法是成功的关键。对特定的蛋白质，如果能够找到特异专一性的检测方法，可以极大地提高研究的效率。在分子生物学和蛋白质工程研究中，对不同功能蛋白质特异性检测方法的研究，也是重要的研究方向之一。,（一）蛋白质结构分析方法 蛋白质结构分析方法主要是指与研究蛋白质的空间结构有关的理论与技术。主要包括： 蛋白质一级结构（即氨基
10、酸序列）的测定方法、蛋白质晶体学、核磁共振法、蛋白质折叠过程研究、蛋白质生物物理研究法以及蛋白质工程的计算机辅助设计与模拟研究等。 1.蛋白质一级结构分析方法 蛋白质一级结构研究，即氨基酸序列的测定，其原理是片段重叠、逐级降解、cDNA以及质谱法等几种，其中片段重叠和逐级降解是最常用的方法。,2.蛋白质构象研究方法 在蛋白质高级结构研究方面，X光衍射和三维核磁共振是蛋白质空间构象研究最主要的分析手段，分别用于对结晶蛋白质和溶液中蛋白质空间构象的研究。X光衍射主要对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分析，对蛋白质分子的整体空间构架研究作用很大。而三维核磁共振可以直接对水溶液中的蛋白质结构进行分析
11、，溶液中的空间构象更接近于生物体中的自然状态，更能反映蛋白质在执行功能时的实际构象状态。,3.蛋白质折叠过程研究方法 蛋白质折叠过程研究方法，也就是蛋白质折叠机理研究，是蛋白质化学及分子生物学最前沿的课题之一。 目前对蛋白质折叠研究主要通过对蛋白质变性、复性过程的热力学和动力学的研究，以及对折叠中间体的研究而进行。 变性、复性过程反映了蛋白质中肽链的折叠、卷曲过程。定量地观察、描述和研究蛋白质变性、复性过程，可以研究肽链的折叠过程。热力学研究反映了过程中的能量状态，动力学研究反映了折叠、卷曲过程与时间之间的关系。通过研究折叠中间体来研究折叠途径也是一种常见的方法。,蛋白质从天然状态到变性状态，
12、或从伸展状态折叠到天然构象，是一个渐变过程，其间必然要经过许多中间过渡态，那些较为稳定的过渡态是折叠过程的限速步骤，这种较为稳定的肽链构象称为折叠中间体，它可以有效地反映蛋白质的折叠途径。尽管绝大多数折叠中间体很不稳定，由于三维核磁共振技术的发展，加上氢交换技术及快速混合技术的成熟，已经可以有效地研究这些中间体。,4.蛋白质生物物理研究方法及计算机结构模拟研究 蛋白质的结构研究方法，除了以上的实验方法以外，理论分子生物物理学方法也是重要的途径之一。随着生物物理、化学以及数学学科的发展，特别是分子力学、分子动力学的发展及其与计算机信息处理技术的结合与发展，利用蛋白质分子内部及其周围环境原子之间的
13、作用，以计算机信息处理系统为工具，研究蛋白质的能量、结构、热力学、动力学性质，进行蛋白质空间结构规律研究和预测，取得了突破性的进展。 理论分子物理学方法的建立，使蛋白质结构的研究摆脱了必须完全依赖实验过程的传统模式，开辟了利用计算机模拟研究的新思路，推动了蛋白质结构研究的进程。,（二）分子生物学研究方法 基因工程方法，也称分子遗传学方法，是一类涉及遗传物质基因（DNA）的生物学理论与操作技术，包括寡聚核苷酸（又称为寡核苷酸）片段及基因的人工合成、目的基因的克隆与分析、目的基因的定位诱变或随机诱变、目的基因在载体系统中的高效表达等。,1.寡聚核苷酸片段及基因的人工合成 由于DNA自动合成仪的广泛
14、应用，寡聚核苷酸片段及基因的合成，即DNA的化学合成，现已经成为分子生物学及遗传工程、蛋白质工程研究中的常规技术手段之一。无论从合成寡聚核苷酸片段的长度，还是合成的总量来说，都已经达到相当的规模水平。合成的产物DNA片段也有着多方面的用途，除合成全基因或改造基因这一基本用途外，还可用作探针筛选目标基因，作为引物用于基因的定位诱变或聚合酶链式反应（PCR），也可合成连接接头（1inker）用于基因末端改造等，还可以用于研究基因的调控及基因与其他生物大分子的相互作用。,2.目的基因的克隆与分析 应用于蛋白质工程中目的基因的克隆与分析技术，与常规基因工程中的方法没有本质的差别。一般也包含下面几个基本
15、部分：源DNA的获得；DNA片段与克隆载体的体外连接；重组后载体引入宿主复制放大建立克隆基因库；筛选基因库，获得目的基因克隆；目的基因的结构分析。,3.目的基因的定位诱变 定点突变（site-directed mutagenesis）技术是对已知DNA序列的基因或基因片段中任意指定位置进行突变的技术。它可以按照人们的意愿在指定的位置实现核苷酸的取代、插入或缺失。 优点：比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的优点，在蛋白质工程中主要应用于需要改变的氨基酸残基位置可以预先确定的情况下。 目前常用的定点突变方法：寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变和盒式
16、突变。,（1）寡核苷酸引物介导的定点突变 原理：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制，将引物中的突变引入到基因中（图）。 步骤：将待突变基因克隆到突变载体上。制备含突变基因的单链模板。引物与模板退火5端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA。合成突变链，在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全民的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子。转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因。对突变体基因进行序列分析。,缺点：常常会产生突变效率较低的现象，主要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统所致。 进展：近年来这一方法已有了许多改进，如尿嘧啶取代法、缺口双链DNA法、双引物法等均是利用对大肠杆菌碱基错配修复系统的抗性来提高突变率的。另外也有人采用改进的质粒作为载体，省去了单链模板的制备步骤，节省了时间。,（2）PCR介导的定点突变法及其改进大引物突变法
