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1、,课 程 设 计 思 路,突变:易错PCR pETBlue-2 纯化：Ni2+螯合层析 荧光光谱仪 双光束紫外分光光度计,碱性磷酸酶的定点突变,反应体系 ddH2O X uL 2.5mmol/L dNTP 4uL 10xbuffer Mg2+Free 5uL 引物 （10umol/L） 2uL/each 模板DNA 1uL ExTaq E 0.3uL（1.5U）,Mg2+（mM） 2，3，4，5，6，7 Mn2+（mM） 0，0.05，0.10，0.15，0.20,（94 ,1 55 ,1 72 ,2）30个循环, 72 ,10,0.8%琼脂糖凝胶 1xTAE,PCR产物的回收(博大PCR产物
2、快速胶回收试剂盒） 1. 切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液，550C溶胶(一定要完全溶解)。 2. 装柱，12000rpm离心30秒，去除废液。 3. 漂洗:500uL漂洗液，12000rpm,30秒漂洗一次，去除废液,重复漂洗一次。 4. 12000rpm,2分钟，换成干净的无菌1.5mL小管。 5. 向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。 6. 12000rpm,30秒。 7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。 8. 12000rpm,2分钟。 9. SYBR检测回收产物,质粒DNA的提取 接含pETBlue-2(质粒的单
3、菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 4000rpm、离心1min，收集所有菌体 150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清, 加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性 12000rpm，离心10min 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min 上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min ,上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min 1
4、2000rpm，离心10min 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） 12000rpm，离心5min 沉淀于超净台中风干 沉淀加入20uL RTE，600C水浴30分钟溶解 -200C保存,370C酶解3小时 酶切产物的纯化和回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒） 每100uL溶液加入700uL溶胶液，其余的操作步骤同前。 向柱子的正中央加20uL洗脱buffer，其余的操作步骤同前。,酶切和连接,控制载体和目的基因的比例为1：310 140C连接过夜 200C保存，用于转化受体细胞,感受态细胞的制备 1. 预培养：接DE3PlacI单菌落到含34ug/mL Cam的3mL LB培
5、养基中，370C、190rpm振荡培养过夜 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含34ug/mL Cam的40mL LB液体培养基的锥形瓶中， 370C、250rpm振荡培养2.5-3小时（OD600 0.4-0.5） 3. 将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min 4. 40C， 4000rpm ，离心10min 5. 到出培养液，将管倒置使培养液流尽 6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 10mL，用5 mL枪头轻轻吹散菌体细胞，冰浴30min,7. 40C， 4000rpm ，离心5min，去上清 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 2mL用枪轻吹悬浮细
6、胞，冰上操作 9. 分装细胞200uL/份，此为感受态细胞（也可于-700C或-200C冻存） 取200uL感受态细胞，加入连接产物10uL 取200uL感受态细胞，加入质粒DNA 2uL（550ng)（阳性对照） 取200uL感受态细胞，加入2uL无菌水（阴性对照） 取200uL 0.1 mol/L的CaCl2 ，加入连接产物2uL （阴性对照） 用枪头混匀，冰上放置30min,转化,1.,2. 420C水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 复苏 每管加800uL LB液体培养基，370C慢摇1小时（150rpm ） 选择性筛选 将复苏菌液4000r/min离心1min，先吸去900uL上清，再
7、将细胞吹散 成细胞悬液，取50uL细胞悬液直接涂布在选择平板(50ug/mLCarb, 34ug/mL Cam, 40ug/mLBCIP)上，倒置培养过夜（370C）,注意：无菌！动作轻！冰浴！高温！,表达与活性检测,1.预培养：分别接一含pETBlue2AKP表达质粒和蓝斑的单菌落 到3mL含50ug/mL Carb、34ug/mL Cam和1Glucose(葡萄糖)的LB 液体培养基中，370C、190r/min振荡培养过夜； 2.将过夜培养的菌液0.5mL接种于35mL含50ug/mlCarb和34ug/ml Cam的表达培养基中， 370C、250rpm振荡培养3小时，至OD600 0
8、.6-0.8； 3. 加入IPTG（终浓度：50umol/L ），继续在370C、250rpm振荡培 养5小时； 4. 40C， 6000rpm离心10min，菌体破碎测活比较。,单克隆抗体,动物免疫,ELISA检测BSA小鼠抗体的效价,选择杂交瘤细胞,细胞融合,克隆的检测,杂交瘤细胞克隆与保存,1. 包被特异性抗原：将BSA用包被液稀释至2 ug/ml，每孔加入 100 ul， 37 2小时； 2. 封闭：弃包被液，每孔加入200ul封闭液，37孵育1小时； 3. 加一抗：弃封闭液，甩干，每孔加入一抗(,PBS稀释液、阴性血清、 小鼠抗血清1:500,1000,2000,4000,8000,
9、16000)100ul，37孵育 2小时； 4. 洗涤: 弃一抗，甩干，手工洗涤，洗三次，甩干。 5. 二抗: 每孔加入100ul二抗（HRP标记），37孵育1h。 6. 洗涤:弃二抗，甩干，手工洗涤，洗三次，甩干。 7. 显色:每孔加入显色剂（TMB）100ul，显色后加入终止剂(2M H2SO4)50ul。（蓝色变成黄色,则为阳性）。 8. 酶标仪450nm测OD值。,ELISA检测BSA小鼠抗体的效价,饲养细胞的准备 选用与免疫小鼠相同品系的610周龄的BALB/C小鼠，拉紧处死，浸 泡于75%酒精内35min； 2. 用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后从两边向小鼠北部方向 剪开，充
10、分暴露腹膜； 3. 用无菌注射器注入23ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）； 4. 反复冲洗，吸出冲洗液。冲洗液放入10ml离心管，800rpm/分离 56min； 5. 用10%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞 数至1105/ml，加入96孔板，100l/孔； 6. 放入370C CO2孵箱培养。,细胞融合,1. 最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，浸泡于75%酒精内35min； 2. 用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后从两边向小鼠北部方向剪 开，充分暴露腹部； 3. 换一套镊子和剪子，用镊子提起腹膜，用剪刀剪开； 4. 在换一套无菌镊子和剪子，取出脾脏，放入培
11、养皿中，培养液洗一次； 5. 将脾脏研碎，过不锈钢筛网到盛有的无血清RPMI-1640培养基的培养 皿中； 6. 离心，细胞用无血清培养液洗2次，最后留1ml制成细胞悬液； 7. 取少量细胞血液稀释10倍，然后用血球计数板计数。,免疫脾细胞悬液制备,骨髓瘤细胞的制备 1. 选择处于对数生长期的骨髓瘤细胞，因为其为半贴壁细胞，所以可 以将其直接吹打下来制成细胞悬液； 2. 离心，换无血清培养基再洗两次； 3. 留下1ml无血清培养基制成细胞悬液。取少量稀释20倍后血球计数 板计数。,细胞融合 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：5的细胞比例混合在一起，即最终将细胞悬液等体积混合； 在10ml离心管中用无血
12、清培养液洗1次，800rpm离心8min； 弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度，轻 轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动； 4. 90秒内加入37预温的1ml 50%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻 微摇动，37水浴作用90秒； 5. 5min内加入20ml 37 预温的无血清培养液以终止PEG作用； 6. 800rpm离心6min，弃上清，用完全培养基重悬细胞； 7. 将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100l。 8. 将培养板置37、5% CO2培养箱中培养。,1. 在接种到96孔板5天后，半量换培养液为HAT选择培养液； 2. 选择培养期间，一每23天换一半培养液。在用HAT选择培养12天 内，将有大量瘤细胞死亡，34天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集 落； 3. 经57d，骨髓瘤细胞全部死亡后，吸出一半的HAT培养液，加入HT培 养液，以后每34d半量换液一次。一孔有多个克隆的将其挑选后，分 别在不同的孔中培养。,杂交瘤细胞的筛选,
