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1、细胞培养发展历史,1885年 Wilhelm Roux 将鸡胚髓板在温热的盐水中维持存活 若干天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年 Amold 把桤木的木髓碎片接种到蛙皮下，当白细胞侵入 到木髓碎片后，他将这些白细胞收集到盛有盐水的小碟 中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活一个短的时 间。 1902年 哈泊兰德 预言植物细胞的全能性 1903年 Jolly 将蝾螈的白细胞保存在悬滴中并维持了1个月。 1906年 Beebe&Ewing 在动物的血液中尝试培养了传染狗淋巴肉 瘤病毒的细胞。,1907年 Ross Harrison （美国） 将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋
2、巴液凝块中，这些组织在体外不但存活若干周，而且居然从细胞中长出了轴突（神经细胞）。 意义：公认的组织培养开始标志； 解决了轴突发生的争论； 培养方法将培养物放在盖玻片上并 倒置于凹玻片腔中培养。,在没有抗生素的条件下，使鸡胚心脏细胞维持生存34年，先后传代3400次。,1934年 荷兰温特 发现生长素，并证实了对植物细胞 培养的作用 1937年 高特里特,诺比考特(法) 几乎同时离体培养 了胡萝卜组织，并使细胞增殖 1940年 Earle 建立了可无限传代的C3H小鼠的结缔组 织细胞系L系（曾在体外经甲基胆蒽 转化）。 1951年 Gay 建立了人第一个细胞系人体宫颈癌 Hela细胞系（原报道
3、为鳞癌，1971年更 正为腺癌）。,动物细胞的生长,动物细胞特性: 真核细胞基本结构：亚显微水平(0.2m) 膜囊结构质膜，核膜，内膜系统 纤维结构染色质，细胞骨架系统 颗粒结构核糖体,细胞器的化学组分：,有机分子：蛋白质类（结构蛋白，分泌蛋白，酶等） 脂类（磷脂，卵磷脂，脑磷脂，心磷脂） 多糖类（糖脂，糖蛋白等） 核酸类（DNA,RNA等） 固醇类（胆固醇等）,无机分子：水（结合水，游离水） 无机离子（Na+,K+,Ca2+,Mg2+),细胞质膜生物学特性：,对水具有很强的通透性 对脂溶性物质的通透性大于非脂溶性物质 电阻率很高，一般在1091011 表面张力较低,细胞膜下皮质层:,微丝(m
4、icrofilament,MF) 中等纤维(intermediate filament,IF) 微管(microtubule,MT),动物细胞之间的连接形式,紧密连接(tight junction) 间隙连接(gap junction) 隔壁连接(separate junction)无脊椎动物细胞 中间连接(intermediate junction)脊椎动物细胞 桥粒连接(desmosome junction),培养细胞的生物学特征,1.贴壁型细胞 2.悬浮型细胞,上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞型 多形性细胞,培养细胞的生长特点,1.贴附 影响因素：离子（Ca2+) 机械、物理因素（低温
5、、培养液流动过快） 生物因素（生长因子）,2.接触抑制,3.密度抑制,培养细胞的生长与增殖过程,单个细胞的生长过程 细胞周期 G1持续时间长短差异大 S 时间较恒定，平均6-8hr G2对环境敏感 M 持续时间很短,细胞系的生长过程,细胞在培养中存活时间的长短，主要取决于细胞的种类、性状、和原供体的年龄等。,三个生长阶段： 原代培养期从体内取出组织接种培养到第一次传代的 阶段，一般维持14周。 传代期 衰退期,每代细胞的生长过程,每代细胞一般经过三个生长阶段： 潜伏期 指数生长期 停止期（平台期）,群体细胞的生长过程,潜伏期(1atent phase),初代培养细胞贴壁较慢，约2496小时，
6、连续细胞系和恶性细胞系贴壁较快，24小时。 潜伏期 细胞接种量接种量大比接种量小的潜伏期短 潜伏期长短 细胞种类初代培养细胞潜伏期长 培养基性质,对数生长期(logarithmic growth phase),接触抑制(contact inhibition),正常细胞会因为细胞接触而发生相 互抑制分裂和限制运动的现象。,对数生长期最具活力时期（细胞分裂旺盛，分 裂相增多。） 细胞分裂指数(mitotic index，MI) MI(分裂相个数1000个细胞)100,稳定期(stationary phase),培养空间和营养物质有限 代谢废物积累,新分裂细胞数=死亡细胞数 （稳定期）,注：细胞代谢
7、活动仍在进行中,衰亡期(senescence phase),营养物的耗尽 有害物质作用,死亡细胞数分裂细胞数 （衰亡期）,培养细胞的遗传学特征,1.染色质与染色体 原代培养多呈二倍体 长期传代发生偏离二倍体现象 2.细胞性别 Barr小体 Y小体,体内外细胞的差异及培养细胞的分化,体内外细胞的差异 培养细胞的分化,细胞培养液,常用液体 1.水 2.平衡盐溶液 3.消化液 4.消化酶抑制液 5.pH调整液,平衡盐水BSS,用途: 作为培养基的基础液 洗涤组织、细胞等,成分： 无机盐 葡萄糖,作用： 维持渗透压，调节pH， 供给能量和无机离子,常用:Hanks液 Earle液 PBS,配制要求:防
8、止钙沉淀 良好的缓冲作用,细胞消化液:,胰蛋白酶(trypsin)溶液 浓度0.125%和0.25% 最适条件pH8.0 37 配制无Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液 Versen液，常用浓度0.02 其他：链霉蛋白酶，骨胶原酶，透明质酸酶,消化酶抑制液,大豆胰酶抑制液,终浓度：0.1% 0.5% 常以DMEM/F12培养液配制 过滤除菌 -20 保存,pH调整液,3.7，5.6，7.4NaHCO3溶液 0.22m滤膜过滤除菌 NaHCO3+H2O Na+OH-+ H2O+CO2 HEPES 0.22m滤膜过滤除菌,抗生素溶液：,青、链霉素(双抗) 青霉素
9、抑制细菌细胞壁的合成 100U/ml 链霉素抑制细菌蛋白质的合成 100g/ml 卡那霉素 制霉菌素,谷氨酰胺补充液,溶液中不稳定 过滤除菌 -20 保存,培养基天然培养基、合成培养基,营养成分： 氨基酸：L型 单糖：葡萄糖 维生素 其他成分 ：核酸降解物、抗氧化剂等,促生长因子及激素 pH 渗透压,天然培养基,血清 组织提取液 鸡胚汁 鼠尾胶原 水解乳蛋白,血清,种类: 小牛血清 牛血清： 新生牛血清 胎牛血清 马血清 鸡血清 兔血清 羊血清,主要成分：,各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。,血清的主要作用：,提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子 提供激素和各种生
10、长因子 提供结合蛋白 对培养中的细胞提供某些保护作用,使用血清的缺点：,可能改变某种细胞在体内的正常状态。,取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞 产生潜在影响，可能导致实验失败或实验 结果的不 可靠性,每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致,血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用,血清的质量标准,理化性质（渗透压、pH、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等） 微生物检测（细菌、真菌、支原体、病毒等） 促生长效果,血清的使用与储存,使用前处理： 灭活处理56，30min 目的去除血清中的补体成分，避免补体 对细胞产生细胞毒作用 储存条件：储存于-20 ，避免反复冻融 使用浓度：一
11、般为5%20%，常为10%,合成培养基,无机盐 基本组分： 氨基酸：12种必需氨基酸 维生素 碳水化合物：葡萄糖 （酚红）,1951年,EarleEarle基础合成培养基MEM (minimum essential media),合成培养基常见种类:,MEM DMEM(Dulbeccos modified Earle medium) RPMI 1640 199,109培养基 HamF10, HamF12适合于单个细胞分离培养 McCoys 5A适合于原代细胞培养，适合于较难培 养的细胞的培养,无血清培养基,无血清培养基即不需要添加血清就能维持细胞在体外较 长时间生长繁殖的合成培养基。,基础培养液,HamF12 1,DMEM 1,添加组分,促贴壁物质,促生长因子及激素,酶抑制剂,结合蛋白和转运蛋白,微量元素,种类：,不含蛋白质，只有成分已知的小分子物质和带微量元素的聚合物，价格便宜，适于某些确立的细胞系；,含有纯大分子物质，如蛋白质、激素等。适用 的细胞株较多，但成本较高，大多无血清培养 基属于此类；,所含成分不完全清楚，以成分简单、成本低而 适于大规模生产使用。,
