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1、基因工程 表达蛋白质的基本原理和应用,mRNA的生物合成 蛋白质生物合成 原核生物表达系统 真核生物表达系统 蛋白质的纯化方法,遗传信息的传递过程,转录,转录,翻译,DNA,RNA,mRNA,蛋白质,基因表达,蛋白质生物合成的基本原理,参与蛋白质生物合成的物质包括: 1、三种RNA mRNA（messenger RNA） rRNA（ribosomal RNA） tRNA（transfer RNA） 2、20种氨基酸作为原料 3、酶及众多蛋白因子 4、ATP、GTP、无机离子等,mRNA的生物合成 (转录),目的基因 RNA聚合酶 启动子 转录终止信号 转录因子等等,启动子是DNA分子可以与RN
2、A取聚合酶特异结合的部位,也就是转录开始的部位。 某个基因是否表达决定于特定的启动子的起始转录。 以开始转录生成RNA 5端 第一个核苷酸的位置为1,以负数表示上游的碱基数，正数为下游碱基数。 转录的起始点不是翻译起始点。,启动子,原核生物启动子 5- TTGACG - TATAA - 起始位点-3 -35区 -10区 +1（A、G） Pribnow框,真核生物启动子 5-GC-CAAT- -TATA -起始位点-3 -80-110区 -75区 -25区 +1（A、G） Hogness框,-35区与-10区之间的距离大约是1619bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。强启动子-
3、10和-35区之间的间隔为171 bp，增加或减少都能明显影响启动子强度。,-10区与-35区的最佳间距,在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达系统最基本的条件。 不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA，弱的则相反。 外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。 带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。 解决的办法：引入强启动子并控制克隆基因在宿主细胞生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。,调节型强启动子,转录终止信号即终止子，其作用是使RNA聚合酶在DNA模板的特异位点终止RNA的
4、合成。,转录终止信号,(DNA)3-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA-5 (RNA)5-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH-3 通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停止； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,RNA聚合酶,蛋白质的生物合成（翻译）,mRNA起始翻译受下列因素影响 mRNA的核糖体结合位点 AUG前后
5、的核酸序列,SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5末端非翻译的前导区内，其起点距翻译起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3 -11bp）。 SD序列与16s rRNA3末端碱基AUUCCUCC互补，控制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译效果。 mRNA5-UAAGGAGGU-AUG 16S rRNA3 -AUUCCUCCA-,mRNA的核糖体结合位点,大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3-端的互补性,DB 序列 5-AUGAAUCACAAAGUG-3 DB 序列（ do
6、wnstream box ）位于起始密码下游，16S rRNA的1469-1483 碱基互补。这个序列也影响mRNA的起始翻译。 真核生物无SD序列，但是有一个Kozak序列，这个序列影响真核mRNA的起始翻译。这个序列-3位的A最重要，而且在+4位最好是嘌呤，G是最优的碱基。,AUG前后的核酸序列,遗传密码与tRNA,除了极个别情况,遗传密码在所有的有机体内是相同的,但是不同的有机体内不同密码子的使用程度不同。而这种不同是由于tRNA在不同的机体内的丰度不同。, N端fMet或Met的切除 二硫键的形成 特定氨基酸的修饰 切除新生肽链中非功能片段 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 糖基化，
7、磷酸化等等,蛋白质前体的加工,不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白都有一段信号肽，即在蛋白质合成过程中N端有一1536个氨基酸残基的肽段-信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。,蛋白质的分泌,一些信号肽的一级结构,蛋白的分泌（一）,蛋白的分泌（二）,蛋白的糖基化,革兰氏阳性菌蛋白的分泌,革兰氏阴性菌蛋白的分泌,多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴侣（chaperones)或称分子伴侣（
8、molecular chaperones)辅助下完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到介导各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折叠成天然构象的具有生物学活性的蛋白质。,伴侣蛋白,理想的表达载体质粒包括： 一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点 一个调节型的强启动子 一个选择性标记 一个复制起点 一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白标签 一个转录终止信号 一个分泌信号肽（分泌型）,表达载体质粒,融合蛋白,融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用： 提高外源蛋白在表达系统中的稳定性 增加外源蛋白在表达系统中的表达量 增加
9、目的蛋白的溶解性 作为抗原的标记蛋白 易于外源蛋白的纯化,融合蛋白作为抗原的标记蛋白,C-myc 标记蛋白,V5 标记蛋白,MBP麦芽糖结合蛋白,Amylose树脂,MBP,Factor Xa 蛋白酶切割位点,10 mM 麦芽糖,目的蛋白,融合蛋白易于外源蛋白的纯化,融合蛋白的纯化,非融合蛋白的纯化,原核生物表达系统,原核生物表达系统:大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌 大肠杆菌表达体系的优点： 积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应的载体可供选择应用 易于进行遗传操作和高效表达 操作安全，致病能力低 生长迅速,培养代谢易于控制,成本相对低等等,大肠杆菌表达体系的缺点 缺乏真核生物的转录后
10、和翻译后加工机制，不宜表达真核生物的蛋白 缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构, 常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解 细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热,大肠杆菌表达体系的转录调控,P：启动子 O：操纵子 I：调节基因,I,P,O,CAP,调控序列,z y a,结构基因,乳糖操纵元（lac operon）：,大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元，操纵元包括相关结构基因及其上游的调控序列。,z：-半乳糖苷酶 y：通透酶 a：转乙酰基酶,乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负性调控而实现的： 大肠
11、杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于阻遏状态。i基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。 R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表达）。, 当有乳糖存在时，乳糖与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的空间构象，使阻遏蛋白四聚体解聚成单体，失去与o的亲和力，与o解离，基因转录开放。 异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactoside IPTG），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏蛋白特异性结合使阻遏蛋白R构象变化，诱导lac操纵元的
12、开放，但本身不受-半乳糖苷酶的催化分解而十分稳定。,CAP(cAMP activated protein)的正性调控 cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成少，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高，cAMP与cAMP的受体蛋白 CRP （cAMP receptor protein）结合变为CAP，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。,在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活 乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏 一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因 此R
13、NA聚合酶难以与其结合。CAP能提高RNA聚合酶与启动 子结合常数： CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。 CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。,由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利用乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。,由于P1ac是弱启动子，实际上的基因工程应用中，通
14、过1ac启动子-10区核苷酸突变产生的1acUV5启动子经常用于质粒表达载体中，这种启动子比野生型1ac启动子更强。,pET表达载体,pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。 T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。 T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、DE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。 在pET表达载体的T7启动子的下游有一个lac操纵子序列，这个载体还有一个带有常规启动子以及编码lac阻遏蛋白的序列（l
15、ac I）。T7启动子、lac操纵子和lacI位置交错。,pET表达载体在DE3溶原状态下的大肠杆菌中， lac阻遏蛋白可以作用于大肠杆菌染色体上，抑制宿主菌转录T7RNA聚合酶，也作用于T7启动子、lac操纵子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。(保证表达质粒在宿主菌中的稳定),T7lac启动子的调控,另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性、编码表达少量T7溶菌酶的宿主菌（pLysS和pLysE）中表达。 T7溶菌酶是一种双功能蛋白：它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层，也可与T7RNA聚合酶结合，阻止转录。,pET表达载体的功能非常强大，即使pET表达载体上的
16、T7启动子只是造成低水平的本底表达，通常也会造成敏感宿主菌生长困难以及表达宿主中质粒不稳定。所以常用的克隆宿主菌是NovaBlue,JM109以及DH5。,表达宿主菌（ pLysS和pLysE 等）,抗生素抗性,pET系列的载体有kanR或ampR的筛选标记。 kanR pET载体中kan基因与T7启动子反向，因此诱导T7启动子并不会增加kan基因产物产量。相反， ampR pET载体的-内酰胺酶基因位于T7启动子的下游并与之同向。虽然所有的pET表达载体都带有位于-内酰胺酶基因前的天然T7转录终止子（T），但是这个终止子只有大约70%的效率，T7RNA聚合酶仍能读通从而除了产生目的RNA外也有少量的-内酰
