《流式细胞术du》ppt课件

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1、第六章 流式细胞术,第六章 流式细胞术,第一节 流式细胞术概述 第二节 流式细胞术发展简史 第三节 流式细胞仪主要技术指标 第四节 流式细胞仪主要构造和工作原理 第五节 流式细胞术常规检测时的样品制备 第六节 流式细胞计的调试和使用 第七节 流式细胞术的应用,第一节 流式细胞术概述,流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是上世纪七十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。 可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等; 可对群体细胞在单细胞水平上进行分析， 在

2、短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度大于95%。,FCM特点 测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞； 可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义； 是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果； 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。,FCM发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果，在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等基础学科和医学、检验学等应用学科得到广泛应用。 目前使用的流式细胞

3、仪主要由美国的两个厂家生产：BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。 流式细胞仪主要有两型：临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。综合型除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，多用于科学研究。,第二节 流式细胞术发展简史,1934年，Moldavan首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。,1953年Crosland-Taylor根据雷诺对牛顿流体在

4、圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。,1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。 1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的

5、细胞，再由光电检测设备计数的装置。 1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。,现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的。 1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：(1)细胞的组分是可以用光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。(2)细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。 Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个

6、采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。,流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。 1967年该研究组研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。 Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。,第三节 流式细胞仪主要技术指标,3

7、.1 流式细胞仪的分析速度 3.2 流式细胞仪的荧光检测灵敏度 3.3 前向角散射（FSC）光检测灵敏度 3.4 流式细胞仪的分辨率 3.5 流式细胞仪的分选速度,3.1 流式细胞仪的分析速度 一般流式细胞仪每秒检测10005000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。 3.2 流式细胞仪的荧光检测灵敏度 最多能测出单个细胞上达600个的荧光分子，两个细胞间的荧光差大于5%即可区分。 3.3 前向角散射（FSC）光检测灵敏度 前向角散射反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2m0.5m。,3.4 流式细胞仪的分辨率 用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到低于2.0%，这也是测量标

8、本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 3.5 流式细胞仪的分选速度 一般流式细胞仪分选速度大于1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。,第四节 流式细胞仪主要构造和工作原理,4.1 流动室及液流驱动系统 4.2 激光光源及光束形成系统 4.3 光学系统 4.4 信号系统（检测、存储、显示和分析） 4.5 细胞分选系统,流式细胞仪结构示意图,4.1 流动室及液流驱动系统 流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件 流动室由石英玻璃制成 单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔 检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束

9、下细胞成单行排列依次通过激光检测区。,流动室孔径有60m、100m、150m 、250m等多种，供检测者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成。 调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。,4.2 激光光源及光束形成系统 流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关。 激光是一种相干光源，能提供单波长、高强度、高稳定性的光照。

10、流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用氩离子气体激光管（波长488nm），此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633nm）和/或紫外激光管。,在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22m66m) 椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。,4.3 光学系统 流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，可分为流动室前和流动室后两组。 流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束

11、，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰。 流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。,滤光片主要有三类： 长通滤片(LP)只允许特定波长以上的光线通过。 短通滤片(SP)只允许特定波长以下的光线通过。； 带通滤片(BP)只允许特定波长的光线通过。 不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT)，如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525，接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575，接收红色荧光(CY5)的P

12、MT前面配置的滤光片是LP650和BP675。,4.4 信号系统（检测、存储、显示和分析） 当测定标本在鞘流液的约束下，细胞成单行排列依次通过激光检测区时，产生散射光和荧光信号。 散射光分为： 前向角散射或0散射（Forward Scatter，FS） 侧向角散射或90散射（Side Scatter，SS）。 散射光是细胞的物理参数，与细胞样本的制备(如染色)无关。,前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由正对着流动室的光电二极管装置，接收并转变为电信号。 侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状，它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号，这些电

13、信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。,荧光信号也有两种： 一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。 一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。 这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由，以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。,流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种，其分子结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长。 如氩离子气体激光管，它的发射光波488nm。 氦氖离子气体激光管发射光波长633nm。 488nm激光光源常用的荧光染料

14、有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。,各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后，存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。 信号存储时，数据一般是以List mode（列表排队）方式存入的。 采用List mode方式有两大优点：节约内存和磁盘空间；易于加工处理分析。 List mode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图等。,(1)单参数数据显示和分析,细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示 横坐标表示散射光或荧光信号

15、相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的 纵坐标表示细胞数。,(2)双参数数据显示和分析： 细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、假三维地形图、等高线图和密度图显示和分析。,二维点阵图 前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中的细胞可以很容易地圈“门”( Bitmap，无定型门)，从而分析各亚群细胞的数据,假三维地形图 X轴：SSC；Y轴：FSC；Z轴：细胞数。仪器的计算机很容易给出两种荧光的测定值：阴性细胞%、两种荧光各自的阳性细胞%、两种荧光的双阳性细胞%、各群细胞的平均荧光强度等。,等高线图 分别是测定细胞的

16、两种荧光双参数数据，横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定“十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。,(3)三参数数据显示和分析： 细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。 三个荧光数据关系可以用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C- 、 A-B+C+、 A+B-C+ 、A+B-C-、 A-B+C-、 A-B-C+、A-B-C-）。,列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式 三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。 可用List Mode中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，“一调二”就是在一维图上调出二维图来；“二调一”就是从二维图中调出一维图来。下图给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。,从二维图设窗调出直方图示意,4.5