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1、项目 五 薄 层 色 谱 法 TLC Thin Layer Chromatography,科学家在研究植物叶子的色素成分时，将植 物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。按光谱的命名方式，这种方法因此得名为色谱法。,一、色谱,在色谱法中，静止不动的一相（固体或液体）称为固定相（stationary phase） ；运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相（mobile phase）.,二、薄层色谱构成,1、固定相 硅胶为使用最广泛的薄层材料 氧化铝有碱性、中性、酸性 硅藻土为化学中性吸附剂 纤维素天然多糖类 聚酰胺
2、为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性。,2、载板玻璃板 放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥，置干燥器中备用。要求光滑、平整、洗净后不附水珠。,3、黏结剂 无机黏结剂石膏（硫酸钙），添加石膏的吸附剂以字母“G”表示。没有黏结剂的吸附剂以字母“H”表示。 有机黏结剂羧甲基纤维素钠（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。,4、荧光黏结剂 在吸附剂中添加某种荧光指示剂，常用的荧光指示剂 在254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。 在366nm有荧光的指示剂如彩蓝等。
3、 含有荧光指示剂的商品吸附剂以“F”表示，并以下标注明其激发光波长。例 硅胶HF254,薄层板活化（可直接用商品TLC，不需活化） 涂布后的薄层先在室温下晒干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如： 硅胶 110 1h 氧化铝 110 30min,三 、TLC操作步骤,制样 选择溶剂，并加热溶解少量样品（约0.01g即可） 要求选择溶解样品的溶剂有高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。,点样 用酒精灯拉细的毛细管蘸取少量样品溶液点在硅胶板上， 样品点应尽可能小。 点样量应适中，过浓会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍几十倍为宜
4、。 采用多次点样法，第二次点加样应待前一次点样的溶剂挥发后再进行。 同一快硅胶板上同时点多个样时，每个样需点在同一高度 手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 5ul）。,展开 多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。,直立式层析缸示意图 1-层析缸； 2-薄层板 3-展开剂饱和蒸气；4-展开剂,检测 物理方法紫外光下显示荧光或荧光淬灭,检测 化学方法加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏、线性良好。 斑点定位方法 碘蒸气法灵敏、简便，为通用显色法。将碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内充满紫色的碘蒸气。将展开后的板挥干溶剂置碘缸中至薄层色谱
5、上出现棕色斑点。,保留参数（Rf值）计算 概念：用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。 计算方法：Rf=Ls/L,原点,S,参比,样品,Ls,L（前沿）,Lr,原点,参比,样品,前沿,四、流动相与展开体系选择,液-固吸附 在该色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于三个因素：,溶 解 能 力,相互作用,1、溶剂强度参数及溶剂选择 溶剂的强度参数 定义：溶剂强度参数用表示。流动相强度越高，表示它与吸附剂相互作用力强。溶质的Rf值就越大。为得到满意的分离，选用的流动相使溶质的Rf值在0.3 0.7之间为宜。 溶剂强度也可用其在水中的溶解度参数 来表示。,一些常用溶剂的溶剂强
6、度与溶解度参数 溶剂 溶剂 正己烷 0.01 7.3 石油醚 0.02 8.2 苯 0.32 9.2 乙醚 0.38 7.4 二氯甲烷 0.42 9.6 正丙醇 0.82 10.2 正丁醇 0.70 / 四氢呋喃 0.57 9.1 乙酸乙酯 0.58 8.6 氯仿 0.40 9.1 甲乙酮 0.51 / 二氧六环 0.56 9.8 吡啶 0.71 10.4 丙酮 0.50 9.4 乙醇 0.88 / 乙酸 1.00 12.4 二甲亚砜 0.75 12.8 甲醇 0.95 12.9 乙二醇 1.11 14.7 甲酰胺 / 17.9,2、溶剂选择原则 增加溶剂强度，则Rf值增大，但可能降低分离能力
7、 流动相中较强组分的体积比小于5%或大于50 % ，选择性最大。 用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，由于形成氢键可改善选择性。 若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，或降低薄层活性，有利于改善分离。,药物鉴别采用标准对照法 含量测定主要用于中药有效成分的分析 杂质检查 杂质对照品法 高低浓度法 药物标准品对照法,五、应用,任务1、检验某样品的纯度 样品1：溶解少量样品1进行薄层检测并计算Rf值 溶剂：乙醇 展开剂：石油醚：乙酸乙酯=4：6 （体积比） 任务2、混合物的分离 样品2：溶解少量样品2进行薄层检测并计算Rf值 溶剂：95%乙醇 展开剂：石油醚：乙酸乙酯=3：7（体积比） 任务3、 选择最佳Rf值（0.30.7） 样品3：溶解少量样品2进行薄层检测并计算Rf值 溶剂：95%乙醇 展开剂：自己配置,
