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1、第三节 酶活力及酶动力学,一、酶活力 1、酶活力的测定 酶活力的表示方法: 酶活力：是指酶催化某以化学反应的能力，可用在一定条件下酶催化某一化学反应的反应速度来表示，即单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，一般用单位时间内产物生成量来表示。 V=S/t和V=P/t,U（酶活力）单位：表示酶量的多少，酶活力单位与所采用的测定方法，反应条件等因素有关。国际酶学会提出使用统一的国际单位IU，即最适条件下25，每分钟催化1微摩尔底物所需要的酶量。,2、酶的比活力 比活力=活力单位系数/每毫克酶蛋白 是表示酶纯度的一个指标。 3、酶转换系数 表示酶的催化中心，每个活性中心或酶分子底物转换底物的分子
2、数。,4、酶活力的测定：,比色法：产物与试剂生成有色物质，根据颜色深浅来计算。 分光光度法：底物和产物光吸收性质不同，可根据吸收光谱的变化来计算。 滴定法：产物之一是酸或碱可以使用此法。 量气法。 同位素测定法。 酶联法：S+E SE1 D+E2 DE2 F D：不能检测或不容易检测 F：容易检测,旋光法 量热法 层析,计算题,1、有1克淀粉酶制剂，用水溶解成1000毫升，从中取出1毫升测定淀粉酶活力，测得每5分钟分解0.25克淀粉。计算每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位。（淀粉酶活力单位的定义是：最适条件下每小时分解1克淀粉的酶量称为1个活力单位。） 解：1、由题可知，1/1000克的淀粉酶能在
3、5分钟内分解0.25克淀粉，1小时内1/1000克的淀粉酶能分解的淀粉为：0.25（60/5）=3克； 2、由淀粉酶活力单位定义（每小时分解1克淀粉的酶量称为1个活力单位），可知1/1000克的淀粉酶的活力单位为：3； 3、所以，1克的淀粉酶制剂的活力单位为31000=3000。,2、 用AgNO3对在10毫升含有1.0毫克/毫升蛋白质的纯酶溶液进行全抑制，需用0.342微摩尔AgNO3，求该酶的最低分子量。 答：1、已知酶溶液的浓度是1.0毫克/毫升，体积是10毫升，因此该酶溶液中所含的酶蛋白质量应为：1.0毫克/毫升10毫升=10毫克； 2、 而所用的抑制剂AgNO3的物质的量为0.342
4、微摩尔，因为是求酶的最低分子量，则可假设酶只含一个活性中心，抑制剂与酶的作用关系是等分子数进行，则该酶溶液中所含酶的物质的量即为：0.342微摩尔。 3、 因此该酶的最低分子量为：10毫克/0.342微摩尔=2.92104。,2、影响酶作用的因素,1)、酶浓度对酶反应速度的影响 在有足够底物和其他条件不变的情况下，反应速度与酶浓度成正比 。,当SE时，V=K3E,2)、底物,3)、温度对酶反应速度的影响,一方面是温度升高,酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度条件下,反应速度最大。,最适温度不是
5、一个固定的常数，它随底物的种类、浓度, 溶液的离子强度, pH, 反应时间等的影响。,例: 反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。,4)、pH对酶反应速度的影响,酶反应的最适pH（optimum pH）,酶的最适pH也不是一个固定的常数，它受到底物的种类、浓度; 缓冲液的种类、浓度; 酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。,例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时,s为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 s为2.5x10-2 M，最适pH为10.0,pH影响反应速度的原因,( 1 ) pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的 解离状态。,( 2 ) 过高、过低的pH导致酶蛋白变性。,
6、5)、激活剂对酶反应速度的影响,酶的激活剂,1. 无机离子,（1）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、 Cu2+、Zn2+、Fe2+等。,（2）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN- 等,（3）氢离子,凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如：Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。,2. 有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA 激活酶原的酶,6)、抑制剂对酶活性的影响,使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。抑制剂并非变性剂，抑制剂具有不同程度的选择性。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： a.在化学结构上与被抑制
7、的底物分子或底物的过 渡状态相似。 b.能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定 的复合体或结合物。,抑制剂类型和特点,竞争性抑制剂 可逆抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂,非专一性不可逆抑制剂 不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂,抑制作用的类型： (一)不可逆抑制作用： 抑制剂与酶反应中心的 活性基团以共价形式结 合，引起酶的永久性失 活。如有机磷毒剂二异 丙基氟磷酸酯。 抑制胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱不能被分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使神经处于过渡兴奋状态，因此此类化合物又称神经毒气。,有机磷化合物：抑制蛋白酶或酯酶活性,萨林,有机砷化合物：与酶的巯基结合而抑制活性,（二）可逆抑
8、制作用(reversible inhibition),E+I EI,抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。,二、酶动力学,1、单底物酶促反应动力学,1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。,根据中间产物学说，酶促反应分两步进行:,米氏方程的推导：,米氏方程,当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = S 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 因此
9、,米氏常数的单位为mol/L。,米氏常数的意义及测定,Km 米氏常数 Vmax 最大反应速度,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,米氏常数Km的意义,不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。,米氏常数的
10、测定,基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,A. 取米氏方程式的倒数形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,米氏常数Km的测定：,B、E-H法,两边分别乘以Km+SS，得,v=-Kmv/S+Vmax,酶的Km在实际应用中的意义,鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。 判断酶的最适底物（天然底物） 。 计算一定速度下底物浓度。 了解酶的底物在体内具有的浓度水平。 判断反应方向或趋势。 判断抑制类型。,可逆抑制(r
11、eversible inhibition) 及其动力学,E+I EI,可逆抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类。,1. 竟争性抑制,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。,+ I,EI,ES,P+ E,E+S,竞争性抑制作用,磺胺类药物可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，影响FH2的合成，导致细菌生长繁殖受抑制，达到治病效果。,例: 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用,此酶的
12、竞争性抑制剂还有：,竞争性抑制作用动力学,竞争性抑制作用动力学,竞争性抑制作用特点：,1）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似，二者竞争酶的结合部位。,4）Vmax不变，Km增大,2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。,3）可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,2. 非竟争性抑制,酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导致酶活性下降。抑制剂与活性中心以外的基团结合，不与底物竞争酶的活性中心，所以称为非竞争性抑制剂。 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑
13、制。,非竞争性抑制作用,+ I,EI+S,ESI,ES,P+ E,E+S,+ I,实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+） 金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）,非竞争性抑制特点： 1）抑制剂与底物结构不相似，抑制剂与酶活性 中心以外的基团结合。 2）Vm下降，Km不变 3）非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法 来消除。,非竞争性抑制作用动力学,3、反竞争性抑制作用,酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。,反竞争性抑制特点： 1）抑制剂与酶和底物的复合物结合。 2）Km和Vm下降 3）底物浓度增加，抑制作用加强。,反竞争性抑制作用动力学,有无抑制剂存
14、在时酶促反应的动力学方程,表观,2、双底物酶促反应动力学,一）、顺序机制：底物的结合和产物的释放按一定顺序进行。 A、有序顺序，为底物，为底物。,B、随机顺序，为底物，为底物。,序列机制的底物动力学方程及动力学图, 在B的浓度达到饱和时A的米氏常数, 在A的浓度达到饱和时B的米氏常数, 底物A与酶结合的解离常数, 底物A、B都达到饱和时最大反应速率,随第二个底物浓度的增加， Km降低和Vm提高,二）、乒乓机制：底物与酶结合和产物的释放是交替进行的。为底物，为底物。,（2）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图, 在B的浓度达到饱和时A的米氏常数, 在A的浓度达到饱和时B的米氏常数, 底物A、B都达
15、到饱和时最大反应速率,随第二个底物浓度的增加， Km和Vm均提高,三）、非米氏酶反应动力学， Rs协同指数或饱和比值。,别构酶与非调节酶动力学曲线的比较,例题,为了确定某酶的催化反应的初速度的底物依赖关系，制备了一系列的l00ml含有不同底物浓度的反应混合物。向每个混合物加入相同量的酶后便开始反应。通过测定每单位时间（分钟）所形成的产物量而获得催化反应的初速度，其结果如下表所示。,把表中的数据绘制成图，在给出的酶量下的Vmax是多少? 根据米氏方程，用Vmax、和S推演出Km的代数表达式。计算每个反应混合物的Km。 Km值取决于底物浓度吗? 当底物浓度为0.1molL1和ll07molL1时，计算它们的初速度。 反应混合物保温2分钟后确定反应的初速度。当初始底物浓度为1102molL1时，计算产物的生成量。在2分钟后底物总量的百分之几被转换?,
