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1、生命化学基础,第二章 蛋白质的共价结构,2,一、蛋白质通论,蛋白质： 核酸：,蛋白质和核酸构成了细胞内原生质的主要成分，而原生质是生命现象的物质基础,激素、维生素、辅酶,3,（一）蛋白质的分类,传统分类法,4,（一）蛋白质的分类,单纯蛋白质的分类,5,（一）蛋白质的分类,缀合蛋白质的分类,6,（一）蛋白质的分类,蛋白质按生物学功能分类,1 酶(enzyme)：如核糖核酸酶、胰蛋白酶、果糖磷酸激酶、乙醇脱氢酶、 过氧化氢酶和苹果酸酶（malic enzyme） 2调节蛋白(regulatory protein)：如胰岛素、促生长素(GH)、促甲状腺素 (TSH)、乳糖阻抑物、核转录因子1(NF1
2、)和分解代谢物激 活剂蛋白 3转运蛋白(transport protein)：如血红蛋白、血清清蛋白和葡糖转运蛋白 4储存蛋白(storage protein)：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白 5收缩和游动蛋白(contractile and motile protein)：肌动蛋白、肌球蛋 白、微管蛋白、动力蛋白 (dynein) 和驱动蛋白 (kinesin) 6结构蛋白(structural protein)：如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、 丝蛋白和蛋白聚糖 7支架蛋白(scaffold protein)：如胰岛素受体底物1、A激酶锚定蛋白和 信号传递转录激活剂 8保护和开发蛋白(
3、protective and exploitive protein)：如免疫球蛋白、凝 血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇（蜂）毒蛋白、白喉毒 素和蓖麻毒蛋白 9异常蛋白(exotic protein)：如应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白,7,（一）蛋白质的分类,根据形状和溶解度分类 1.纤维状分子 (fibrous protein),线性分子，有规则，细棒或纤维状 结构蛋白不溶于水；血纤蛋白原溶于水,原胶原 胶原纤维,300nm，1.5nm,8,（一）蛋白质的分类,2. 球状分子(globular protein) 疏水链在球内，外部是亲水侧链 水溶性好，细胞内大部分水溶性蛋白 质是球蛋白
4、3. 膜蛋白 (membrane protein) 疏水侧链暴露于外部。 氨基酸组成：极性残基比球蛋白少 水不溶性蛋白,9,（二）化学组成和分子量,蛋白质的元素组成： C：50%，H：7%，O：23%，N：16%， S： 03%，其它 1% (金属离子等) 复杂体系中蛋白质含量的估算：,10,（二）化学组成和分子量,蛋白质的分子量范围很大：60001106,M = 12600,M = 5700,M = 12500,M = 13900,M = 16900,M = 64500,M = 150000,M = 600000,单体蛋白,寡聚体蛋白,一条肽链一个亚基,11,（二）化学组成和分子量,蛋白质的
5、分子量是整个功能体系的分子量 寡聚蛋白的分子量是亚基分子量之和 单独的亚基不具有完整的功能，功能体系称蛋白质 蛋白质是均一分子，其氨基酸组成、亚基个数、肽链长度都完全相同 它可以从组织中直接分离，而不是体外组装，有些蛋白质甚至可以得到结晶形式,12,（三）蛋白质结构的组织层次,蛋白质的一级结构 多肽链由氨基酸首尾相连而成，蛋白质的一级结构就是多肽链的氨基酸序列 一级结构含有结构信息，包括蛋白质分子如何折叠，走向，在何处需要-螺旋或-折叠,13,（三）蛋白质结构的组织层次,蛋白质的二级结构 多肽链内的氨基酸之间或多肽链间的氨基酸之间通过氢键形成的-螺旋或-折叠等形式 二级结构是肽链在空间结构中的
6、一个高级组织层次,14,蛋白质的三级结构 肽链借助各种非共价力进行弯曲、折叠形成的具有特定走向的紧密球状结构,多肽链在三维排列中的高级组织层次,寡聚蛋白质中具有特定三级结构的亚基之间在空间上的相互关系和结合方式,蛋白质的四级结构,15,(四)、功能的多样性,主要生物功能 1、催化功能：催化生物体内的生物化学反应 核糖核酸酶、胰蛋白酶、果糖磷酸激 酶、乙醇脱氢酶、过氧化氢酶 2、调节功能：调节其它蛋白的生理活性 胰岛素、促生长素 3、转运功能：将某特定物质从一地转移到另一地 血红蛋白、葡糖转运蛋白,蛋白质种类：10101012,16,4、储存功能：储存某种物质 铁蛋白、卵清蛋白（氮素是生长的限制
7、 性养分） 5、运动功能：可以给予细胞运动能力 肌动蛋白、微管蛋白、动力蛋白和驱动 蛋白 6、结构成分：给细胞和组织提供强度和保护 胶原蛋白、蛋白聚糖 7、支架作用：通过蛋白-蛋白相互作用来识别和结 合其它蛋白中的某些结构元件并装 配成多蛋白复合体，参与对激素和 其它信号分子的协调和通讯,8、防御和进攻：对机体的正常运行具有保护能力 免疫球蛋白，抗冻蛋白、凝 血酶、血 纤蛋白原 9、异常功能（其它功能）：具有的功能不易归属 如应乐果甜蛋白、胶质蛋白,17,蛋白质的序列异构现象是生物功能多样性的结构基础,(四)、功能的多样性,18,(一)、肽和肽链的结构,含几个氨基酸残基的肽称为几肽,二、 肽,
8、氨基酸通过肽键线性聚合成肽,小肽，寡肽，多肽，氨基酸残基,蛋白质由肽链组成，肽是氨基酸的线性聚合物,19,(一)、肽和肽链的结构,肽的主链结构相同,由N-C-C序列重复排列,20,(二)、肽的物理化学性质,1、离子晶格 熔点高 溶液中为偶极离子形式 酸碱性（末端氨基、羧基和R基） Glu、Lys 2、滴定曲线： 小肽与氨基酸类似 滴定曲线有等电点，为多价离子等电点,21,表45 某些肽的pKa,22,(二)、肽的物理化学性质,4、化学反应,肽链末端-COOH和-NH2的反应，如肽的定性,弱酸性,加热,3、肽具有旋光性,23,含两个或两个以上肽键的化合物与CuSO4在碱性溶液中反应生成蓝紫色复合
9、物,利用该反应可定性了解蛋白质水解程度，测定蛋白质含量,二肽和氨基酸无此反应,24,(三)、活性多肽,动植物体内存在许多具有生理活性的多肽，多肽药物已获得人们的重视 二肽：肌肽 -Ala-His，抗氧化，抗自由 基，消炎，调节免疫。 甜二肽 Aspartame Asp-Phe-OCH3, 比蔗糖甜200倍,25,(三)、活性多肽,三肽：谷胱甘肽 -Glu-Cys-Gly，维持 红细胞内蛋白质（如血红蛋白） 中Cys-SH处于还原态,26,(三)、活性多肽,四肽：促胃酸激素 五肽：脑啡肽，内源性吗啡，与吗啡受体 结合 蛋氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheMet 亮氨酸脑啡肽 TyrGlyGly
10、PheLeu 八肽：有些蕈(mushroom)可以致人于死地， 因为它能产生剧毒毒素，其中一种叫 -鹅膏蕈碱,27,(三)、活性多肽,-鹅膏蕈碱是一个环状八肽，能与真核生物的RNA聚合酶结合，抑制其酶活性，使RNA的合成停止。但它不影响原核生物的RNA合成,28,九肽：,牛催产素,牛加压素,十肽：,短杆菌肽,抗生素,抑制革兰氏阳性菌,局部用于治疗及预防化脓性病症,29,(三)、活性多肽,十六肽： 内啡肽，有镇痛作用 二十四肽：促皮质素，治关节炎，商品化 二十六肽：蜂素溶血肽，抗关节炎 五十一肽：胰岛素，降血糖,血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI） Captopril、Enalapril,血管紧张
11、素转化酶（ACE）抑制剂（ACEI）的开发是近代高血压治疗史上的重大进展,30,三、蛋白质一级结构的测定,生物化学中的里程碑 1953年，F. Sanger 牛胰岛素(bovine insulin) 氨基酸序列,为结构与活性关系(SARS)的研究提供信息,31,(一)、蛋白质测序的策略,样品：均一，纯度 97%，已知相对分子量,Sanger法测序步骤 1、测定多肽链数目 确定N-末端或C-末端残基的摩尔数,末端残基不相同时，表明蛋白质由不同肽链组成,32,变性剂： 8M 尿素，6M 盐酸胍 断裂二硫桥,2、建立测序参考点 鉴定末端残基，测定每条多肽链的氨基酸组成 3、降解多肽链 得到二套以上的
12、肽段进行组成和末端残 基分析 4、氨基酸测序（Edman法、酶解法、质谱法） 5、构建完整肽链 6、确定二硫键位置,拆分亚基,33,(二)、N-末端和C-末端氨 基酸残基的鉴定,1、N-末端分析 1）二硝基氟苯（DNFB 或 FDNB）法 Sanger反应,34,(二)、N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定,2）丹磺酰氯（dansyl chloride， DNS）法 5-dimethylamino- naphthaline-1- sulfonyl chloride,优点：灵敏度比DNFB法高100倍,35,3）苯异硫氰酸酯（PITC）法 Edman法 特点：能依次从肽的N-端逐一切割氨基酸残基,
13、4）氨肽酶法 亮氨酸氨肽酶，焦谷氨酸氨肽酶 特点：从肽链 N- 端逐一降解氨基酸，适用于N- 端的氨基酸残基被封闭的肽（如环肽）,36,(二)、N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定,2、C-末端分析 1）肼解法：,Gln、Asn、Cys被破坏, Arg转变为鸟氨酸,37,2）还原法 还原，水解，用HPLC等方法分离鉴定 3）羧肽酶法 特点：从羧端逐一降解氨基酸,CPA：水解除 Pro、Arg、Lys 外的所有 C-末端残基 CPB：只水解Arg、Lys为末端的肽链 CPY：所有氨基酸,38,(三)、二硫键断裂,39,(四)、氨基酸组成分析,酸水解方法：6 mol/L HCl, 110 特点：氨基
14、酸不消旋 缺点：Trp完全破坏 Ser、Thr、Tyr部分破坏 Gln、Asn的酰氨基被水解,碱水解方法：5mol/L NaOH，110 特点：Trp可定量回收 缺点：大部分氨基酸被破坏,40,(四)、氨基酸组成分析,41,(五)、多肽链的部分裂解,降解,分离,1、酶切法： 优点：专一性强，断裂点明 确，反应产率高 酶：蛋白水解酶（protease） 常见蛋白酶： 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶， 嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶等 在肽链内有固定的酶切位 点，也叫内切酶或内肽酶 （endopeptidase）,42,1) 胰蛋白酶(Trypsin) 特点：水解碱性氨基酸的-COOH形成的肽键 马来酸酐可保护L
15、ys 1,2环己二酮能修饰Arg胍基,2）糜蛋白酶(Chymotrypsin) 水解-COOH端为芳香族的氨基酸 也水解疏水氨基酸Leu、Met或His的 -COOH端肽键 裂解能力受邻近氨基酸残基影响 碱性残基和酸性残基,44,3）嗜热菌蛋白酶（Thermolysin） 依赖Zn2和Ca2，可用来断裂较短的多肽链 4）胃蛋白酶（Pepsin） 要求芳香氨基酸和疏水氨基酸，断裂肽键 的二侧残基都是疏水氨基酸。最适pH2 5）木瓜蛋白酶（Papain） 对免疫球蛋白有特殊作用 6）葡萄球菌蛋白酶 (Staphylococcal protease) 磷酸缓冲液 (pH 7.8): Glu和Asp的
16、-COOH端肽键 碳酸氢铵缓冲液 (pH 7.8) 或醋酸缓冲液 (pH 4.0)： 只断裂Glu残基-COOH端的肽键,45,(五)、多肽链的部分裂解,2、化学法 优点：专一性好，肽段大，适于自动化测序 溴化氰断裂法： CNBr 只断裂-COOH端为Met的肽键，生 成肽酰高丝氨酸,47,(六)、肽段的氨基酸测序,第一步：偶联反应,条件：弱碱性，PITC只与未质子化的游离NH2反应,1、Edman化学测序法（1950）,苯氨基硫甲酰肽,48,(六)、肽段的氨基酸测序,第二步：环化断裂,第三步：转化反应,PTH-氨基酸非常稳定，max = 268nm,49,(六)、肽段的氨基酸测序,优点：连续测定60-70个残基 缺点：繁琐、工作量大 发展：DNS-Edman降解，荧光标记PITC,2、酶降解法： 外切酶：氨肽酶和羧肽酶 限制：只能测定末端附近很少几个残基 3、质谱法： 电喷雾电离质谱(ESI)可进行小肽测序,50,(
