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1、第三章 DNA重组的基本操作,一、核酸的分离提取 二、电泳技术 三、外源DNA片段的制备 四、转化方法 五、重组克隆的挑选,一、核酸的分离提取(isolate),（一）、DNA的提取,一般原理： 细胞分散：动物组织采用匀浆法；植物组织材料采用液氮法；微生物材料收集细胞，采用离心法。 细胞破碎：对于动物材料，直接加入去污剂（多位SDS),有细胞壁结构的细胞，用分解细胞壁的酶处理，如溶菌酶处理大肠杆菌；用纤维素酶处理植物细胞等。然后用去污剂处理使细胞膜破裂，原生质体释放。 去除蛋白：蛋白酶K处理；酚/氯仿抽提。,去除RNA: RNase 处理。 核酸沉淀：乙醇沉淀；异丙醇沉淀。 溶解：1XTE 溶
2、解 定性分析：电泳分析，根据标准分子量标准确定大小、纯度（有无RNA） 定量分析：电泳，以标准含量的DNA确定浓度；紫外测定OD260。 质量：OD280/OD260.,DNA提取操作实例：,质粒DNA的提取 碱裂解法,溶液1GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA，20mmol/L 20mMTris-HCl pH8.0， 100g/ml RNas A 4oC 保存。 溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液: 10mmol/L
3、，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇,1.质粒扩增 1.1.从Amp抗性培养的培养平板上挑取生长状态好的单菌落，置于4ml的100ug/ml的AmpLB液体培养基中，37，120rpm空气摇床培养4-5小时，待培养物约为对数生长期，用于扩大培养。 1.2取500ml离心瓶，含有200ml的LB培养基（LB培养基配置见试剂配制），将过夜培养物，以备质粒提取。 2.质粒提取 2.1.取250ml离心瓶，将过夜培养物（200ml菌液）倒于离心瓶中，4000rpm，4，离心15分钟。 2.2.上清液小心转入废液杯中，沉淀为菌体。将沉淀打散，加入4ml
4、质粒提取液I，室温放置5分钟。 2.3.将所有液体倒入50ml离心管中（以下操作都在50ml离心管中进行），加入质粒提取液II 8ml，混合后于室温放置5分钟。加质粒提取液III6ml，混匀，可见白色沉淀，冰上放置15分钟。 2.4. 10000rpm，4，离心15分钟，取液相。加入等体积的异丙醇混合，20放置15分钟。,2.5.10000rpm离心,4，15分钟,去上清，沉淀用5ml 1TE溶解后，加5ml 5M LiCl混匀，10000rpm，4离心20分钟。 2.6.取上清，加入等体积异丙醇沉淀，10000rpm离心15分钟。沉淀加入500l 1TE溶液。将所得溶液吸入1.5ml离心管中
5、。再加入3lRNA酶，37放置2小时（以下操作均在1.5ml离心管中进行）。 2.7.加入等体积聚乙二醇溶液。12000 rpm离心10分钟，收集沉淀。沉淀用400l 1TE溶解。 2.8.加入400l饱和酚，混匀，12000 rpm，离心3分钟，取上清至新的1.5ml离心管内。 加入200l饱和酚200l氯仿，混匀，12000 rpm，离心3分钟，取上清至新的1.5ml离心管内。加入400l氯仿，混匀，12000 rpm，离心3分钟。取水相至新的1.5ml离心管内。 2.9.加入35ul 3mol/L,然后加NaAC,700l乙醇沉淀混匀，室温放置10分钟后，于4，12000 rpm，离心5
6、分钟，取沉淀。 2.10.加入200l 80%乙醇洗盐。置于37烘干。 2.11.用100lTE溶解沉淀。,3.检测 3.1电泳检测 3.1.1.配制0.8的琼脂糖凝胶。称取琼脂糖0.24g,置于100ml的三角瓶中，加电泳缓冲液30ml, 放于水平的桌子上，在三角瓶的水位线处作以标记。 3.1.2.用牛皮纸包瓶口，于微波炉中加热至琼脂融化，取出，放于水平的桌子上，用蒸馏水补充到三角瓶的标记处。冷至60时，加溴化乙锭0.005%。 3.1.3.在煮凝胶的同时，准备干净的可盛胶30ml的铸胶托盘一个，用透明胶带封两边的口。至于水平桌面上，放上1mm厚，5mm宽的梳子。 3.1.4.将凝胶倒入托盘
7、中，自然冷却。 3.1.5.上样1ul，15cm/100V电泳1小时。 3.1.6. 观察RNA和核DNA是否除净。（RNA片段较小，跑在最前面；核DNA片段很大，位于胶孔跑不出来）。如果核DNA的亮度强于质粒条带，质粒提取不合格，重新抽提。 3.2OD值的测定 2.2.1.取石英比色杯一支，加3ml蒸馏水，加入DNA溶液10ul用紫外分光光度计测OD260和O.D280。 2.2.2计算公式: DNA含量（ug/ul）=50XO.D260X3/10,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基，37培养1216小时; 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min
8、离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1 ，充分混匀; 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH(内含1SDS)，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;,质粒小量提取的方法：,加入150 l乙酸钾溶液(pH4.8)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置515min; 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; 沉淀用70乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; 加入30-50l灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有
9、时需要酚:氯仿抽提); 将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,WizardTM Plus Minipreps DNAPurification System (Promega) This purification system is silica membrane-based and modified alkaline lysis procedure based system, which specifically absorbs DNA in the presence of high concentration of some salt. Proteins and other impuri
10、ties are not absorbed and will be removed. DNA can be eluted under low-salt condition or water. The yield of plasmid DNA will vary depending on a number of factors.,Cell Resuspension Solution 50mM Tris-HCl (pH 7.5) 10mM EDT 100g/ml RNase A Cell Lysis Solution 0.2M NaOH 1% SDS Neutralization Solution
11、 1.32M potassium acetate (pH 4.8) Column Wash Solution 80mM potassium acetate 8.3mM Tris-HCl (pH 7.5) 40M EDTA 55% ethanol TE buffer (1X) 10mM Tris-HCl (pH 7.5) 1mM EDTA,注意： 用移液器（俗称“枪”）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA); 加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组DNA的断裂而污染质粒DNA！,Pellet 13ml of cells by centrif
12、ugation for 12 minutes at 10,000 g in a microcentrifuge. Pour off the supernatant and blot the tube upside-down on a paper towel to remove excess media. Completely resuspend the cell pellet in 200l of Cell Resuspension Solution (Solution I）. Add 200l of Cell Lysis Solution (Solution II) and mix by i
13、nverting the tube 4 times. The cell suspension should clear immediately.,Add 200l of Neutralization Solution (Solution III)and mix by inverting the tube 4 times. Centrifuge the lysate at 10,000 g in a microcentrifuge for 10minutes. Pipet 1ml of the resuspended resin into each barrel of the Minicolum
14、n/syringe assembly. (If crystals or aggregates are present, dissolve by warming the resin to 2537C for 10 minutes. Cool to 30C before use.),Carefully remove all of the cleared lysate from each miniprep and transfer it to the barrel of the Minicolumn/syringe assembly containing the resin. No mixing i
15、s required. Carefully insert the syringe plunger and gently push the slurry into the minicolumn. Detach the syringe from the Minicolumn and remove the plunger from the syringe barrel. Reattach the syringe barrel to the Minicolumn.,Pipet 2ml of Column Wash Solution (after the addition of ethanol) int
16、o the barrel of the Minicolumn/syringe assembly. Insert the plunger into the syringe and gently push the Column Wash Solution through the Minicolumn. Remove the syringe and transfer the Minicolumn to a 1.5ml microcentrifuge tube. Centrifuge the Minicolumn at 10,000 g in a microcentrifuge for 2 minutes to dry the resin.,Transfer the Minicolumn to a new 1.5ml microcentrifuge tube. Add 50l of nuclease-free water to the Minicolu
