《atp生物发光技术》ppt课件

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1、ATP生物发光技术,楼俊辉 张炜 章建 刘星宇,L O G O,生物发光，即用荧光素酶基因标记细胞或DNA，直 接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为 。观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。 相比于传统（通过不同时间点宰杀实验动物而获得数据）的方法，对一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，更可靠。,L O G O,一，技术原理 二，技术应用 三，技术优势,L O G O,一、技术原理,（1）标记原理 （2）光学原理 （3）实验过程,标记原理,哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达

2、荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素（luciferin），即可在几分钟内生发光现象。 这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。,（1）标记原理,L O G O,通过分子生物学克隆技术，将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，将标记好的细胞注入小鼠体内。观测前需要注射荧光素酶的底物荧光素。荧光素脂溶性非常好，很容易透过血脑屏障。 约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光； 十分钟后强度达到最高；在最高点持续约2030分钟

3、后开始衰落，约三小时后发光全部消失。最好的检测时间是在注射后15到25分钟之间。,L O G O,每次荧光素酶催化反应只产生一个光子：IVIS （infrared videodata imaging system 红外视频数据成像系统成像系统） 一个高度灵敏的制冷CCD相机 将光学信号转化为数字信号； 特别设计的成像暗箱和成像软件 可屏蔽宇宙射线在内的所有射线 观测、记录并分析这些信号,L O G O,光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到（衍射）。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。软件为每一次使用提供一张

4、图片作为数据结果，记录了发射出的光子数据。颜色体现了单位面积中发射光子的数量，信号强度高的为红色，低的为紫色。,（2）光学原理,L O G O, 麻醉系统麻醉小鼠后放入成像暗箱平台 软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯拍摄第一次背景图。 自动关闭照明灯，在没有外界光源的条件下拍摄由小鼠体内发出的光，即为生物发光成像。 与第一次的背景图叠加后可以清楚的显示动物体内光源的位置，完成成像操作。,（3）实验步骤,L O G O,软件完成图像分析过程：使用者可以方便的选取感兴趣的区域进行测量和数据处理及保存工作。当选定需要测量的区域后，软件可以计算出此区域发出的光子数，获得实验数据。,L

5、O G O,二、技术应用,（1）标记细胞 （2）标记病毒 （3）标记细菌 （4）基因表达和蛋白质的相互作用 （5）转基因动物模型,L O G O,（1）标记细胞, 癌症与抗癌药物研究,直接快速地测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估。活体生物发光成像能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。,通过给予肿瘤接种的小鼠不同的剂量，并不同的给药时间、不同的给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量并给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。,L O G O,（1）标记细胞, 癌症与抗癌药物研究,U251-HRE细胞：其中的荧光素酶基因表达受

6、可诱导启动子的操控，低氧状态为其诱导条件。当肿瘤发展到300500mg时，局部组织低氧（微环境），表达； 组织切片也可以观察到生物发光，荧光素酶的体外活性保持时间比较短，约几十分钟； 已商品化的肿瘤细胞株包括：前列腺癌，乳腺癌，子宫颈癌和结肠癌等细胞系模型。,L O G O,（1）标记细胞, 免疫学与干细胞研究,将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨髓，可用于实时观测活体动物体内干细胞造血过程的早期事件及动力学变化。有研究表明，应用带有生物发光标记基因的小鼠淋巴细胞，检测放疗及化疗效果。,可观察流体细胞在体内的动向和变化； 能更快捷地得到免疫系统中病原的转移途径。,L O G O,（1）标记细

7、胞, 细胞凋亡,当荧光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳动物细胞中表达，产生的融合蛋白无荧光素酶活性，细胞不能发光；而当细胞发生凋亡时，活化的caspase-3（细胞凋亡蛋白酶）在特异识别位点切割去掉抑制蛋白，恢复荧光素酶活性，产生发光现象。,检测正在凋亡的细胞状况。,L O G O,（2）标记病毒, 病毒侵袭,以荧光素酶基因标记的HSV-1（1-型单纯疱疹病毒 herpes simplex virus 1）病毒为例，可观察到HSV-1病毒对肝脏、肺、脾及淋巴结的侵袭和病毒从血液系统进入神经系统的过程。,多种病毒，腺病毒，腺相关病毒，乙肝病毒等，已被荧光素酶标记，用于观察病毒对机体的侵染过程。

8、,L O G O,（3）标记细菌, 细菌侵染研究,可以用标记好的革兰氏阳性和阴性细菌侵染活体动物，观测其在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应。,L O G O,（3）标记细菌, 抗生素药物研究,利用标记好的细菌在动物体内对药物的反应，医药公司和研究机构可用这种成像技术进行药物筛选和临床前动物实验研究。,近年来，国际上大型制药公司纷纷将精诺真技术在动物体内的实验结果作为FDA（美国食品和药品检验局）药物申报材料中非常重要的临床前动物实验部分。,L O G O,（4）基因表达和蛋白质相互作用, 组织特异性基因表达,一种细胞可被两种荧光素酶标记：renilla荧光素酶基因由一组成性稳定表

9、达的启动子驱动，作为内参，反应细胞数量的变化；firefly荧光素酶基因由要研究的组织特异性启动子驱动。,这样firefly荧光素酶发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反应特定的启动子在动物体内的表达活性。,L O G O,（4）基因表达和蛋白质相互作用, 基因治疗,基因治疗包括在体内将一个或多个感兴趣的基因及其产物安全而有效地传递到靶细胞。,应用荧光素酶基因作为报告基因用于载体的构建，观察目的基因是否能够在试验动物体内持续高效和组织特异性表达； 插入脂质体包裹的DNA分子中，用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况:容易准备、低毒性及轻微免疫反应。,L O G O,（4）基因

10、表达和蛋白质相互作用, 蛋白质相互作用,将荧光素酶基因分成两段，分别连接所研究的两种蛋白之一的编码DNA，然后导入细胞或动物体内表达为融合蛋白。当两种蛋白有强相互作用时，表达的荧光素酶两部分相互靠近形成有活性的荧光素酶，在有底物存在时出现生物发光，反映出所研究的两种蛋白存在相互作用。,此原理亦可用于研究细胞信号传导途径。,L O G O,（5）转基因动物模型, 基因表达,将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。利用其表达产生的荧光素酶与底物作用产生生物发光，反应目的基因的表达情况（何时、何种刺激下表达），从而实现对目的基因的研究。,动物发育过程

11、中特定基因的时空表达情况； 观察药物诱导特定基因表达； 其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。,L O G O,（5）转基因动物模型, 各种疾病模型,研究者根据研究目的，将靶基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记，同时转入动物体内形成所需的疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等等。,提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应； 评估候选药物和其它化合物的毒性； 为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。,L O G O,三、技术优势,肿瘤转移研究，基因治疗，流行病学的发病学研究，干细胞示踪，白血病的相关研究等是该技术非常有优势的领域。在药物开发方面，用该技术进行肿瘤的药效研究

12、，比传统方法更灵敏，还可以通过一系列转基因疾病动物模型，来快速直观的进行相关疾病的发病机理和药物筛选研究。,L O G O,三、技术优势,（1）无创伤性，可快速扫描，一天可检测几百只； （2）有更高的灵敏度，可以在感染早期就进行活体观察； （3）可以有结构信息，在活体动物整体上观察感染途径； （4）对同一批老鼠自身对照，有效持续观察，减少实验 时间和经费，避免个体间差异 ； （5）定量结果：实验结果以靶细胞单位时间内发射光子数 的绝对量表示，它与标记的靶细胞数量或基因表达情 况直接线性相关。,L O G O,荧光素酶的稳定性,荧光素酶基因是插到细胞染色体内的，当细胞分裂、转移、分化时，荧光酶也

13、会得到持续稳定的表达。 标记的肿瘤接种以后，从理论上讲，会发生luciferase的丢失，但是还没有正式的报道。丢失的量，非常小，可以忽略不记，不会影响实验结果。,L O G O,仪器灵敏度,穿透性可达到34cm。在标记细胞活跃发光的情况下，仪器可以检测到最少100个皮下接种的发光细胞； 若细胞在体内位置深（如原位种植），比如内脏，最少能检测到的细胞数目需要多一些。一般每增加0.5cm可检测到的最少细胞数增加一个数量级。,L O G O,国内首台IVIS Kinetics落户天津生物医药联合研究院 这个技术不仅可以对动物体内的标记细胞和基因的成像中具有精诺真技术的高灵敏度和绝对定量性能，同时还能对动物体内生物学现象的快速变化进行实时成像。这样， IVIS Kinetics 不仅仅是个高灵敏度的摄像机，还是一个高性能的录像机。 它不仅能够实时纪录动物体内离子浓度或神经介质的快速变化，还能够对活跃的小鼠成像，无需麻醉。,Thank you for your attention,