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1、第7章 氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验,氨基酸类药物含量测定常用的方法,1.酸碱滴定法 示例1：谷氨酸的含量测定 示例2：赖氨酸片中赖氨酸的测定,2.非水溶液滴定法 示例：酪氨酸的含量测定 3.定氮法 示例：天门酰氨片的含量测定,赖氨酸片中赖氨酸的测定中,1)为什么要用NaOH调节pH为7.0？ 2）加入甲醛溶液的作用？ 3）是直接滴定还是其他的滴定方式？,非水溶液滴定法,非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐类药物的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。,非水溶剂的种类 (1) 酸性溶剂 有机弱碱在酸性溶剂中
2、可显著地增强其相对碱度，最常用的酸性溶剂为冰醋酸。 (2) 碱性溶剂 有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸度，最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。,定氮法,样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。,4.碘量法或溴量法 示例一：盐酸半胱氨酸水合物的测定 示例一：L-胱氨酸的测定,5.HPLC法 示例一：三氨基酸注射液-341 示例二：六氨基酸注射液400 6.氨基酸自动分析仪,碘量法,原理：半胱氨酸分子中含有SH， 在酸性条件下，与过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠溶
3、液滴定。由硫代硫酸钠溶液所消耗的量，间接求出硫化物的含量。 注意：滴定条件，指示剂，碘滴定液，Na2S2O3 标液配制,碘量法的背景知识 (一) 方法简介 碘量法也是常用的氧化还原滴定方法之一。它是以I2的氧化性和I-的还原性为基础的滴定分析法。因此，碘量法的基本反应是,由E可知I2是一种较弱的氧化剂，能与较强的还原剂作用；而I-是一种中等强度的还原剂，能与许多氧化剂作用，因此碘量法又可以用直接的和间接的两种方式进行滴定。 1、碘滴定法(也称直接碘量法) 电位比EI2/I低的还原性物质，可以直接用I2的标准溶液滴定的并不多，只限于较强的还原剂，如：S2-、SO32-、Sn2+、S2O32-、A
4、sO32-、SbO33-等。,剩余碘量法 在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液，待I2与测定组分反应完全后，再用硫代硫酸钠滴定液滴定剩余的碘，根据与药物作用的碘的量来计算药物含量的方法。,2、滴定碘法(间接碘量法) 电位比EI2/I高的氧化性物质，可在一定的条件下，用碘离子来还原，产生相当量的碘，然后用Na2S2O3标准溶液来滴定析出的I2，这种方法叫做间接碘量法或称为滴定碘法。例如K2Cr2O7在酸性镕液中与过量的KI作用，析出的I2用Na2S2O3标准溶液滴定。 Cr2O72-+6I-+14H+2Cr3+3I2+7H2O I2+2S2O322I-+S4O62 利用这一方法可以测定很多氧化
5、性物质,如ClO3-、ClO-、CrO42-、IO3-、BrO3-、SbO43-、MnO4-、MnO2 、AsO43-、NO3-、NO2-、Cu2+、H2O2等等，以及能与CrO42-生成沉淀的阳离子，如Pb2+、Ba2+等，所以滴定碘法的应用范围相当广泛。,碘量法常用淀粉作指示剂，淀粉与碘作用形成蓝色络合物，灵敏度很高，即使在5106 mol/L溶液中亦能看出。 淀粉指示剂应在近终点时加入，因为当溶液中有大量碘存在时，碘可被吸附在淀粉表面，影响终点的正确判断。 碘滴定液(0.1mol/L) I2=253.81 12.69g1000ml 【配制】 取碘13.0g,加碘化钾36g与水50ml溶解
6、后，加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。,碘量法的主要误差来源，一是I2易挥发，二是I-易被空气中的氧所氧化。 为防止I2挥发，应采取以下措施： 1. 加入过量KI，KI与I2形成I3，以增大I2的溶解度，降低I2的挥发性，提高淀粉指示剂的灵敏度。 此外，加入过量的KI，可以加快反应的速度和提高反应的完全程度。 2.反应时溶液的温度不能高，一般在室温下进行。因升高温度增大I2的挥发性，降低淀粉指示剂的灵敏度。保存Na2S2O3溶液时，室温升高，加速Na2S2O3的分解。 3.析出碘的反应最好在带塞的碘量瓶中进行，滴定切勿剧烈摇动。,为防止I-被空气中的氧所氧化，应采取
7、以下措施： 1.避光 光线能催化I被空气氧化。 2.溶液pH值的影响 S2O32与I2之间的反应必须在中性或弱酸性溶液中进行。因为在碱性溶液中，I2与S2O32将会发生下述副反应： S2O32+4I2+10 OH2SO42+8I十5H2O 而且，I2在碱性溶液中还会发生歧化反应： 3 I2+6OHIO3+5I+3H2O 如果在强酸性溶液中，Na2S2O3溶液会发生分解： S2O32+2H+SO2+S+ H2O 同时，I在酸性溶液中也容易被空气中的O2氧化： 4I+4H+O2=2I2+2H2O,3.在间接碘量法中，当析出碘的反应完成后，应立即用Na2S2O3进行滴定(避免I2的挥发和I被空气氧化
8、)。 （二）应用实例 1.铜矿石中铜的测定 矿石经HCl、HNO3、溴水和尿素处理成溶液后、用NH4HF2掩蔽试样中的Fe3+，使其形成稳定的FeF63-络合物，并调节溶液的pH为3.54.0，加入KI与Cu2+反应，析出的I2，用Na2S2O3标准溶液滴定，以淀粉为指示剂，反应式如下： 2Cu2+4I2CuI+I2 I2十2S2O322I+S4O62 本法可测定矿石中0.5%以上的铜。,2.钡盐中钡的测定 在HAc-NaAc缓冲溶液中，CrO42能将Ba2+沉淀为BaCrO4。沉淀经过滤、洗涤后，用稀HCl溶解，加入过量KI，Cr2O72将I氧化为I2，析出的I2，以淀粉为指示剂用Na2S2
9、O3标准溶液滴定。反应式如下： Ba2+ CrO42BaCrO4 (黄) 2BaCrO4+4H+2 Ba2+H2Cr2O7+H2O Cr2O72+6I+14H+3I2+2Cr3+7H2O I2+2S2O322I+S4O62,HPLC（高效液相色谱）,柱的类型： 检测器类型： 固定相： 流动相：,氨基酸自动分析仪,一种专门用来分析氨基酸的自动化的液相色谱仪。 原理：蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，精氨酸等16种氨基酸。,多肽类药品检测,1.酸碱滴定法 2.紫外分光光度
10、法 3.效价测定法（略） 示例一：抑肽酶效价的测定 示例二：杆菌肽效价的测定,蛋白质类药品的检验,定氮法 电泳法（重点介绍） 生物检定法,电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。 醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm0.15mm为宜。 特点：操作简单、灵敏度高，样品用量少。电泳时间短，一般电泳4560min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。,醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白,效价单位U,效价:指某一物质引起生物反应的功效单位,可用
11、理化方法检测,也可用生物检测方法测定，通常以重量单位或效价单位来计量。不同的药物有各自的效价的定义。 某些生化药物，其药物中含有一些杂质，不可能是纯品。故不能以重量单位准确表示其含量，只能依靠生物检定的方法与标准品进行比较来测定药物的效价剂量。因此，采用特定的“单位”“U”来计量。产生相同效应药品的剂量比较时，所需剂量越小，药物的效价就越高，反之效价就低。,临床上常见到的以效价单位计量的药物有生物制剂如蛋白质类、酶制剂、激素、维生素及部分抗生素类药。这些药物依中国药典规定，均以其特有的药理效价表示剂量。 肝素的效价是以每毫克肝素制剂(602mmHg柱真空干燥3小时)所相当的单位数来表示。1U为
12、24h内在冷处阻止1ml猫血凝结所需的最低肝素量。在制药工业的发展过程中，随着制药工艺的提高，药物的纯度也逐年提高，其生物效价亦随之愈来愈高。该药研制初期的生物效价，每1.0mg效价相当于125U,1977版中国药典规定肝素钠每1.0mg效价不得少于140U，而1995版药典则定为每1.0mg效价不得少于150U，2005年为不少于156U，2010年版改为不得少于170U。,酶类药品检验 -酶活力测定法,酶活力概念,酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。 但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定
13、量，而是对它的催化能力进行定量。所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。,一. 酶活力的测定：,（一）酶活力测定的基本知识： 酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，真正的含酶量并不多。所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。 酶活力是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，而反应时间通常又很短，尤其是在酶活力很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易准确；反之，产物从无到有(如不纯的酶制剂中内源性产物不计
14、的话)，只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故酶活力测定绝大多数是采用测定产物生成速率的方法。,测定酶活力时通常都附有适当的对照(control )以消除非酶促反应所生成的产物，常用的对照有以下几种，可根据具体情况予以选择。 1.样品对照 若测定酶活力的样品是粗提取液，属于非常不纯的酶制剂，往往含有所欲测定的产物，也可能在保温时由于内源性底物的旁反应产生相同的产物，这些可通过不加底物单加样品的样品对照予以消除。 2.底物对照 某些酶的底物能自发(非酶促)地分解成所欲测定的产物，可以通过不加样品单加底物的底物对照予以消除。,3.时间对照 若酶制剂不纯(含有产物)和底物自发分解的情况并存，则必须做一
15、个酶和底物都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。 在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以根据预实验决定。 测定管中的产物量必须减去对照管中的产物才是真正由酶促反应所生成的产物量。,（二）酶活力测定的方法： 酶活力测定要符合两个原则： 在零级反应期测定，即-s或p与反应时间t成正比， 反应速度与酶量成线性关系，即 E= k(-s/ t) = kp/ t 常用的方法有： 1.定时法 2.连续检测法 3.平衡法,如何测定酶活力？,以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应速度曲线
16、,注意：初速度的测定是关键。,可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降,原 因 底物浓度的降低、产物的增加造成的逆反应的加快 产物的抑制作用 酶本身逐渐失活,1.定时法: 测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度 的方法称为定时法。因t1和t2是整个反应历程的两个点，故又称两点法，其中t1一般 取反应开始的时间，在酶反应进行一定时间(t2)后终止反应，如加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等，然后测定底物或产物的变化。 这种方法的优点是简单，因最后测定产物时酶反应已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。缺点是如果不用预试验确定，无法了 解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保证测定结果的真实性。 因此，
