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1、基因诊断和基因治疗 （Gene diagnosis and Gene Therapy）,1,基因诊断,概述,几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后。,基因诊断主要内容 一、基因诊断概念 二、基因诊断常用技术 三、基因诊断策略 四、基因诊断在临床的应用 1. 在遗传性疾病诊断中的应用 2.在传染性疾病诊断中的应用 3.在肿瘤诊断中的应用 4.在法医学上的应用 五、基因诊断存在的问题和发展前景,4,基因诊断的出现： 1976
2、年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交首次对一例珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断。,狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。,基因诊断的概念,核酸分子杂交技术 PCR及其衍生技术 限制性酶谱分析 限制性片段长度多态性分析 寡核苷酸探针杂交 DNA芯片技术 DNA测序技术,二、基因诊断中常用的几种技术,(一)核酸分子杂交技术,(1)方法: 以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信
3、号的检测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析.,(2)几种不同形式的核酸分子杂交 a. Southern印迹(southern blot)杂交: 用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b. Northern印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析 c. 斑点杂交（dot blot): 既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低 d.原位杂交（in situ hybridization): 是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检
4、测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断 分类: 玻片原位杂交:如中期的染色体和组织切片. 膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜),原位杂交的镜像图,(二)PCR技术在基因诊断中的应用,（）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交： PCR-ASO 该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况： PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交不存
5、在这种突变； 只与突变探针杂交-突变基因为纯合子； 与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子； 与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发现的类型,ASO探针杂交检测已知点突变,受检者基因组DNA或含 突变位点的PCR扩增产物 与标记的ASO 探针杂交,ASO1,ASO2,Normal,Hetero,Homo,（）PCR-单链构象多态性（PCR single strand conformation ploymorphism,PCR-SSCP)分析,是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单链DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,
6、形成的构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE电泳中表现出不同的迁移率. SSCP特别适于分析小于400bp 的 PCR产物。据认为SSCP可以区分1bp的差异 PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质,PCR-SSCP分析原理示意,(3)PCR-限制性片段长度多态性（ PCR restriction fragment length polymorphisms,PCR-RFLP）分析,基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制酶对不同个体基因组
7、进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.,限制性片段长度多态性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms),1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱,(4)PCR-变性梯度凝胶电泳分析技术,双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带 优点：可靠，检出单碱基突变率可
8、达 缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变,18,变性梯度凝胶电泳图,荧光定量PCR(FQ-PCR)技术 是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高,特异性强等优点. FQ-PCR技术的两种定量形式: 绝对定量:一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量. 如合成目的基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:稳定,准确. 相对定量:指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因(如-actin, rRNA等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较,反映反应
9、体系内是否存在PCR扩增的影响因素.,(6)定量PCR(quantiative PCR, Q-PCR),(7）DNA序列测序,1.1977年Sanger创建的链终止反应序列测序法 用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA链的延伸，产生长度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。,22,2.自动测序法 采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。 DNA 测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质,（8）DNA芯片技术,DNA芯片（DNA chip)又称为基因芯片，DNA微阵列（DNA microarray)
10、 该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA微阵列。用荧光标记待测样品（DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。,基因芯片技术,25,基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。 该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。,基因表达的分析,三、遗传病的基因诊断,一. 遗传病基因诊
11、断的策略 1.直接策略：采用基因突变的诊断方法，直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆. 2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断.,二、人类基因组上的DNA遗传标记,限制性片段长度多态性(RFLPs ) 1985 短串联重复序列 (short tendem repeats, STRs ,mini- satellites ) 1990s 单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymor-phisms SNPs),短串联重复序列 STRs (short tendem repeats, Microsatellites ),STR广泛存在于人基因组，
12、占约5%，基本单位是1bp-8bp的串联重复，重复次数 n=15-60，已知8000多个 主要形式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ，其中以 (CA)n ， (GT)n 为多见。 1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与RFLP与STR不同,它是直接以序列的变异作为标记,而不是以片段的长度差异作为标记. 人类基因组图谱的初步分析表明，共有3万至3.5万个基因。有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛
13、存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，3-4个相邻的标记构成的单倍型（haplotype）就可有8-16种。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。,单核苷酸多态性 （single nucleotid polymorphism，SNP）,SNP用作遗传标记具有以下优点：, SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。 它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。 与串联重复的微卫星位点(STR)相比，SNP是高度稳定的.尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。 部分位于基
14、因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。 易于进行自动化分析，缩短了研究时间 .,四、基因诊断技术在临床的应用,32,血红蛋白病的基因诊断,分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a链和b链合成不平衡。 （一）异常血红蛋白病的基因诊断： 如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸:GAA(谷)GUA(缬)代替. 对该病的基因诊断应采用: 1)PCR-限制酶切,即用PCR从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段,再选适当的内切酶消化PCR产物,根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断 2
15、)Southern 印迹杂交分析,HbA、HbS和HbC的密码子及蛋白质区别,珠蛋白基因的第6位密码子有三种形式：正常红细胞的基因A、镰状红细胞的基因S和另一种相对常见的血红蛋白C的基因C。,设计一对引物进行PCR扩增，扩增序列中必须包括第5、6、7密码子，扩增后用Mst限制性内切酶对扩增产物进行水解，通过对水解片段的电泳分析或进行Southern杂交分析可以做出正确的诊断。 限制性内切酶Mst识别序列为CCTNAGG，N可以是任意核苷酸。因此珠蛋白基因的第5、6密码子和第7密码子的第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。但是在发生镰状突变后该酶切位点消失。,Mst酶切位点(GCTNAGG),5
16、,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,酶切产物电泳分析,酶切产物Southern印迹杂交分析,用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交检测点突变 被检靶片段经PCR扩增、酶切，并经电泳分离后转移到膜上，与经标记寡核苷酸探针杂交 探针为珠蛋白基因5端的基因片断,图示珠蛋白基因纯合子A（AA）、纯合子S(SS)和杂合子AS个体的DNA杂交结果,PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交 含突变序列的产物仅与突变探针杂交 PCR产物分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交，根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变点,b-珠蛋白基因点突变 GAG(Glu)GTG(Val) bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC bS probe ACTCCTG
