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1、第二节 其它重要的工具酶,DNA 聚合酶（DNA polymerase）,DNA 聚合酶是催化以 DNA 或 RNA 为模板合成 DNA 的一类酶的总称。 经常使用的 DNA 聚合酶有大肠杆菌 DNA 聚合酶 I(全酶)、Klenow 酶、T4 DNA 聚合酶、T7 DNA 聚合酶、耐高温的 Taq DNA 聚合酶以及反转录酶等。 这些 DNA 聚合酶的共同特点是：它们都能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP，包括 dATP、 dTTP、 dCTP 和 dGTP)连续的加到双链 DNA 引物链的 3-羟基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的 DNA 链。,DNA 聚合酶 I,DNA 聚合酶 I 具有三种
2、活性，即 53聚合活性、53外切活性和 35外切活性。 DNA 聚合酶 I 要发挥作用需满足以下三个条件。 底物和激活剂：DNA 聚合酶 I 催化聚合反应需要四种 dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)作为底物，同时Mg2是不可缺少的激活剂。 带有 3-端羟基末端的引物：DNA 聚合酶 I 所催化的聚合反应总是在引物的 3-OH末端基团和搀入的 dNTP 之间发生的，且只能沿引物末端由 53方向延伸。 DNA 模板：可以是 ssDNA 或 dsDNA，后者只有在其主链上有一至数个断裂的情况下才能成为有效的模板。,实验室中，利用 DNA 聚合酶 I，通过 DNA 缺口平移的方法制备
3、DNA 探针，可以用于核酸杂交分析。 双链 DNA 的单链缺口在 DNA 聚合酶 I 的 53外切作用下，从缺口的5端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的 3端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动，这种缺口移动的现象就称为缺口平移。 如果反应中使用的是用同位素标记过的单核苷酸底物，则合成产生的 DNA 分子即可作为带放射性标记的 DNA分子杂交探针。,DNA 聚合酶 I,DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段),是 E. coli DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物，特点是： 具有 DNA 聚合酶活性和 35核酸外切酶活性，但缺失了 53 核酸外切酶活性。 Kle
4、now 既保留了全酶的高保真性，又不会降解 DNA 5末端。 用途：在基因工程中主要用于切口平移法标记 DNA，同时也可用于 DNA 的缺口补平和延伸。,用途： 用随机引物制备探针 补平5突出端，形成平末端 切除3突出端，形成平末端 合成cDNA第二条链 诱变反应中第二条链的合成 双脱氧法DNA序列测定 (Sanger 法),DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段),DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段),T4 DNA 聚合酶,在模板及引物存在的条件下，T4 DNA 聚合酶催化沿 53 方向合成 DNA。此酶还具有 35 外切核酸酶的活性，该活性比 DNA 聚合酶 I 强
5、。与 E. coli DNA 聚合酶 I 不同，T4 DNA 聚合酶不具有 53 外切核酸酶活性。,T4 DNA 聚合酶, 缺口填充 (无链置换活性) 产生平末端的最佳用酶 补平 5 突出端，形成平末端 切除 3 突出末端，形成平末端 通过置换合成法标记探针 单链删除后亚克隆 基因定点突变中第二条链的合成,DNA片段的末端平滑化示例,T7 DNA 聚合酶,T7 DNA 聚合酶是从受 T7 噬菌体感染的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核酸酶。 它由两种亚基组成：一种是 T7 噬菌体基因 5 编码的蛋白质，其分子量为84 kD；另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白(thioredoxin)，
6、其分子量为 12 kD。,T7 DNA聚合酶是目前已知的持续合成能力最强的 DNA 聚合酶，能连续合成数千个核苷酸。 除聚合活性以外，T7 DNA 聚合酶还具有单链和双链的 35外切酶活性，它的活性也很强，约为 Klenow 酶的 1000 倍。 T7 DNA 聚合酶不具有 53外切酶活性。由于 T7 DNA 聚合酶的高度续进性和不受 DNA 二级结构的影响，在分子生物学中常被用于长模板 DNA 的引物延伸反应。同时，经修饰的 T7 DNA 聚合酶还是双脱氧终止法对长片段 DNA 进行测序的理想工具酶。,T7 DNA 聚合酶,碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase）,碱性磷酸酶是
7、一类能特异性地切去DNA或RNA的5-磷酸基团的工具酶，它们的作用底物可以是ssDNA或dsDNA或RNA，也可以是NTP或dNTP。 用途 1）去除DNA片段的5-末端的磷酸基。防止线状DNA的自身环化（Self-Ligation）。 2）除去PCR反应后残存的dNTP。PCR产物进行测序时，在反应体系中如果有多余的Primer和dNTP，将影响测序反应的正常进行。使用Exonuclease I分解残存的Primer；用SAP处理可降解多余的dNTP，之后不需要对PCR产物进行精制，立即可以进行测序反应。,从细菌中分离的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, E.coli C
8、75; BAP) 从小牛肠中分离的碱性磷酸酶 (Alkaline phosphase, calf intestinal, CAP)。 从虾提取的虾碱性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP ）,碱性磷酸酶,碱性磷酸酶,T4 多聚核苷酸激酶 （T4 polynucleotide kinase，PNK）,DNA 或 RNA 5 末端的磷酸化，以便进行连接反应。 DNA 或 RNA 的末端标记，用作探针和进行 DNA 测序。,双链DNA片段的磷酸化,在微量离心管中配置溶液如下：37反应3min,70反应510分钟使酶失活。进一步用酒精沉淀的方法精制DNA。,T4 po
9、lynucleotide kinase 2 l ATP(10mM) 5 l 10 reaction buffer 5 l 双链DNA片段 10 pmol 超纯水 补足 50 l,DNA 酶 I （DNase）,DNA 酶 I（DNase I）是随机水解双链或单链 DNA的一种内切酶，使 DNA 分子降解成带有 5磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸的混合物。 进行重组 DNA 研究时，必须注意防止 DNA 酶的污染，否则制备的 DNA 样品将会降解。 因此使用的器皿或试剂要高温处理，样品中需加 EDTA，或放置冰上以破坏或抑制酶活性。,用 途 1）与DNA Polymerase I 一起用于切口平移（
10、Nick translation）。 2）在Mn2+存在的条件下，为鸟枪法测序（Shot gun sequencing）制作DNA文库。 3）用于足迹法（Foot printing）分析DNA-蛋白质相互作用。 4) DNase I 可以作用于单链 DNA、双链 DNA、染色质和RNA:DNA杂交链。,RNA酶A（Ribonuclease A）,Ribonuclease A是一种内切核糖核酸酶，可在C和U残基位置特异性降解单链RNA。该酶可以切割核苷上5-核糖与邻近嘧啶核苷3-核糖上磷酸基团之间的磷酸二脂键。产生的2，3-环磷酸可以水解成相应的3-核苷磷酸盐。,产品用途： 质粒和基因组DNA制
11、备时用于去除RNA； 重组蛋白质制备过程中，除去溶液中的RNA。,质粒提取后用RNA酶处理,其它的RNA酶,RNA 酶T1只作用于鸟嘌呤核苷酸的3磷酸根，切开与其相邻核苷酸连接的 5磷酸键； RNase H 可以降解 DNA-RNA杂交链中的 RNA分子。,防护RNA酶的污染,人体的分泌物如唾液、汗液中都含有 RNA 酶。 因此在操作 RNA 样品时，必须戴手套，实验用的玻璃器皿都要经 250 烘烤 4h(RNA 酶耐热)，或用 RNA 酶的抑制剂处理。,末端转移酶的主要用途,末端脱氧核苷酸转移酶简称末端转移酶，分子量为 60 kD，来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴样细胞。在二价阳离子的存在
12、下，该酶能够逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性 DNA 分子的3-OH末端。末端转移酶在反应过程中不需要模板的存在。 对不同的dNTP所需要的二价阳离子不同，若加入的核苷酸是嘧啶核苷酸，则Co2+为首选阳离子；如果加入的核苷酸是嘌呤核苷酸，则Mg2+为首选阳离子。 当反应体系中只有一种dNTP时，就可以在DNA分子的3末端加上同聚物尾巴(homopolymeric tail)。,末端转移酶的主要用途,分别给外源 DNA 片段和载体分子加上互补的同聚物尾巴，以使它们可以连接起来。 例如：可以给用做克隆载体的线性 DNA 分子的 3-OH 末端加上poly(dT)尾巴，给待克隆的外源 DNA 片段的
13、3-OH 末端加上poly(dA)尾巴。然后将外源 DNA 连接于载体中，形成重组 DNA 分子。,末端转移酶的主要用途,D N A 连接酶,作用机制及特点DNA 连接酶(DNA ligase)能利用 NAD+或 ATP 中的能量，催化多段 DNA 的 3羟基和5磷酸末端之间形成 3，5-磷酸二酯键，把两个 DNA 片段连接在一起，封闭 DNA 双链上形成的切口(见图 3-3)。连接酶和限制酶一样是基因工程中不可缺少的重要工具。 应当注意，DNA 连接酶只能连接双链 DNA 分子的单链切口(nick)，既不能催化两条单链 DNA 分子的连接(T4 DNA 连接酶例外)，也不能催化双链中一个或多
14、个核苷酸缺失所造成的缺口(gap)。,DNA 连接酶的分类,常用的 DNA 连接酶有 T4 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶两种。 在这两种连接酶中，最常使用的是 T4 DNA 连接酶，它的连接效率高，既可用于黏性末端的连接，也可用于平齐末端的连接。一般来说，片段越小，末端黏性越强，连接反应则可使用较高的温度。DNA 平齐末端的连接比黏性末端连接效率低得多。平齐末端的连接一般需要在 1020 进行，且需要较高的 DNA 浓度和 T4 DNA 连接酶的浓度。而黏性末端的连接一般在 1626 进行。,大肠杆菌 DNA 连接酶催化的连接反应中所需要的能量由 NAD+提供， T4 DNA连接酶
15、催化的反应中所需要的能量由 ATP 提供。其他方面大肠杆菌 DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶的作用机制相同。,各种连接酶特性的比较,反转录酶,商品化的反转录酶有两种，一种来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，另一种来自大肠杆菌中表达的 Moloney 鼠白血病病毒(Mo-MLV)。 它们均具有： 依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶活性； RNase H 活性(即持续地、特异地降解 DNA-RNA 杂交链中的 RNA 链的活性)； 依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶活性。 AMV 及 Mo-MLV 反转录酶在许多方面有差别，如 RNase H 活性强弱，最适反应温度及 pH 等。,反转录酶的主要
16、作用是将 mRNA 转录成双链 cDNA，并可用反转录的 cDNA 进行序列分析，再推导出 RNA 序列。,反转录酶,Taq DNA 聚合酶,Taq DNA 聚合酶是一种热稳定 DNA 聚合酶，因从生存在热泉水中的耐热的水生嗜热菌(Thermus aquaticus)体内分离得到而命名。 Taq DNA 聚合酶最适反应温度是 72 ，但能够耐受 96 ，即使在 100 处理 5 min 也能具有一半活性。这种热稳定 DNA 聚合酶的发现解决了早期 PCR 反应中所存在的 DNA 聚合酶在DNA 变性温度下也会变性的问题，使 PCR 反应实现了自动化循环反应。这也是 PCR 技术能被广泛应用的重要原因。,现在市场销售的 Ta
