酵素纯化方法

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1、B2 酵素純化方法 酵素純化方法 Enzyme Purification 純化酵素前要先把儀器及用具建好，並熟悉所有的基本操作方法，以免事倍功半；最主要的純化工具為液相色層分析法，有很多種操作方式，以應用在各種同的蛋白質樣本。 1 酵素純化實驗室 實驗室的設備與經營管，在有形或無形中，影響實驗的品質或其成敗甚鉅。 1.1 儀器： a. 基本設備： 小型儀器可歸納成 電泳 與 層析 大，大型儀器主要有 心機 及 光計 。 (1) 基本設備有： 純水製造系統、製冰機、高速凍心機 (20,000 rpm)、微心機、電泳及轉印系統 ( 包含供電器) 、 ELISA 光計，及各種層析管柱系統 ( 包含分

2、劃收集器) 。其中電泳與層析包含很多獨的小型器具，使用上較複雜。 (2) 個人電腦及周邊： 今日的實驗室已經開電腦，管是套裝軟體或者網的應用，可缺乏。 (3) 進一步的設備有： 超高速心機、凍乾燥機、超微膜過系統、雙向電泳、等電焦集電泳系統、分光光計 (UV 及可光 )、HPLC 或 FPLC。 (4) 特別的設備有： 液相閃爍計器、原子吸收光譜分析儀、毛細管電泳，其他貴重儀器如：蛋白質定序儀、質譜儀、影像分析系統、分子結構電腦工作站。 b. 儀器管及使用： (1) 每件儀器應指定專人管，負責保管附件、 明書，並做初級保養。儀器能正常使用，並發揮其最大服務功能，則其設置純為枉然。 (2) 光學

3、或密儀器，應放在有除溼機的密閉室；發熱的器具應當集中放在通風好處，並且注意電容是否足夠，以免過荷造成災害。 (3) 使用儀器前，要先熟悉操作法；有問題必請教管人，使用前後應登記 ( 登入、登出) ，有任何毛病要刻反映，可隱瞞。 c. 冰箱： ECX 2005 109 (1) 應妥善規劃貯位，詳細表內藏物品；藥品分用小盒裝在一起 (貨櫃化 )，勿散堆積，以免時翻找費時，導致冰櫃失溫。 B2 酵素純化方法 (2) 下的凍櫃，勿使用無霜冰箱；因為定時除霜裝置會造成冰箱內溫上升，藥品可能會因反 凍結-解凍 而失去活性；得已 使用自動除霜冰箱，可裝在普盒子內，使藥品傷害至最低，也可減輕停電所造成的傷害。

4、 (3) 時時注意冰箱門一定要關好，尤其是以下的冰箱，因門閉緊而造成回溫，對藥品及冰箱是大災難。 1.2 小型器具及消耗品： a. 常用小型器具： 均質機或果汁機、磨粉機、 pH 測定計、天平、水浴、冰筒、自動吸管 (20, 200, 1000 L 三種) 、磁鐵攪拌機、試管振盪器、試管架、滴管。 b. 公用器具： 應集中放在定位，用畢刻清歸位！ 自動吸管應經常校正，可吸取純水在天平秤之，每 1.0 mL 水應秤得 1.0 gm，誤差在 3% 以上，即送修。 c. 常用消耗品： 自動吸管頭 (黃色及色) 、微心管 (microfuge tube)、大小心管、紙、紗布、棉花、手套、擦拭紙、透析袋

5、、保鮮膜、鋁泊紙及玻璃試管等。 1.3 藥品： a. 貯存溫： (1) 每種藥品有其最適當的貯存溫，要遵守； 一般分為： 室溫、4 及 -20三種，又可依其為固体、液体或高純者，分別置放。 (2) 除常用的大宗藥品 (如 NaCl)，較密或穩定的試劑 (如大部分酵素) 最好要大屯積，因為貯藏時間太久無法控制其品質。 b. 分裝凍藏藥品： (1) 由冰箱取出之藥品，應在充分回溫之後，才能開罐。 (2) 使用極頻繁的藥品，應分裝後凍藏 (aliquot)，每次取用一個分裝，可用等待回溫，但用後也再收回凍藏。 c. 藥品純： 一般依純及用途分為級，如 和光 分為： 化學用、一級、特級，Merck 藥

6、品則分為 合成 (for synthesis)、特純 (extra pure)、生化用 (for biochemistry)、試藥 (pro analysis 或 GR)。 各種等級的藥品，應當用在適當的實驗，否則是費，就是因藥品純佳而致實驗失敗。 110 ECX 2005 d. 注意添加物： B2 酵素純化方法 許多商品所供應的酵素，是保存在酸銨懸浮液中，可較為安定；但使用前要先透析，除去酸銨；否則在酸銨下分析活性，會造成誤判。 也要注意酵素的源，及其所含的鹽，會會影響你的實驗。 1.4 個人用品： a. 個人藥品： 所有藥品一定要加標籤 (圖 1.1)，註明 日期、藥品名稱、使用人姓名 等

7、，藥品名稱勿用暗號，以免日後自己忘掉是何試劑。 試劑勿配製過，因大多的藥品在久貯後均穩定；要檢查 緩衝液內有無長霉！ 每個人的藥品應集中一處固定收存，忌到處存放。 b. 刻清洗： 玻璃用具 (如試管、燒杯、三角瓶等 ) 使用後，請儘在當日清洗掉，這是最時的。用清潔液浸泡時，要用洗衣的肥皂粉，要使用液態的洗潔，並應在日內清洗掉，因為可以是越泡越髒的！ c. 做完實驗後： 一定要把所用過的 儀器、實驗桌、用具 等整乾淨，回原。 開前要從頭回顧，檢查所有使用過的儀器或實驗桌，也許會發現重要的藥品或樣本忘收起，或貴重的儀器忘關機。 ECX 2005 111 1 M Tris-HCl pH 8.0Jua

8、ng 990608 姓名縮寫 日期濃 名稱 pH 圖 1.1 藥品試劑標籤 B2 酵素純化方法 2 蛋白質抽取 酵素的純化過程，約可分為三個階段： (1) 粗蛋白質 (crude protein) 採樣 均質打破細胞 抽出全蛋白，多使用鹽析沉澱法；可以粗去除蛋白質以外的物質。 (2) 部分純化 (partially purified) 初步的純化，使用各種管柱層析法。 (3) 均質酵素 (homogeneous) 目標酵素的進一步製純化，可用製備式電泳或 HPLC。 圖 2.1 出其相關的純化及分析方法。 2.1 如何開始？ 先考慮以下點： 5W a. 要純化那一個蛋白質？ What ? b.

9、 為何要純化此蛋白質？ Why ? c. 由何種材純化？ Where? d. 由那一個生長期？ When ? e. 如何純化此蛋白質？ How ? 2.2 材源 a. 材取得： 抽取酵素的材源，通常外動物、植物及微生物，或可用動植物的細胞或組織培養。採樣時，應考慮在那一個生長期、在那一個器官或組織中，有最高的酵素含。 材的採集會大大影響實驗的成敗，遇到材採集有困難，或者材品質穩定時，是花費時間、。 一定要控制穩定的材源！ b. 材的差性很大： 植物細胞比起動物細胞，構造上有許多差，在材的選擇上，應特別注意。植物的細胞壁相當堅硬，要用相當大的去打破。 其細胞內的區隔較動物細胞複雜，有很大的液泡，

10、內藏低 pH 的溶液以及蛋白質等 有害 物質。 另含有体及澱粉，亦是植物細胞的特徵。同源的材，各有特定的採集或抽取問題，大多需要自嘗試解決。 112 ECX 2005 Proteinfractionation(1) CrudeProtein(1%pure)(2) PartiallyPurified(50-90% pure)(3) Homogeneous (99%)MaterialExtractionChromatographyElectrophoresisAB純化階段 分析方法Electrophoresis:Kinetic studyMolecular weight Sedimentation

11、 coefficientdeterminationQuaternary structureIsoelectric focusingPeptide mappingNative-PAGESDS-PAGEGradient PAGEAmino acid analysisAmino acid sequencingExtinction coefficientAmmonium sulfateOrganic solvantGel filtrationIon exchangeAffinity chromatographyFPLCPreparative electrophoresisIsoelectrofocus

12、ingBackground knowledge about MaterialProtein / Activity assayImmunoassays:ImmunoblottingELISADouble diffusionImmunoelectrophoresisAntibody productionMonoclonal or conventional antibodiesX-RaycrystallographySpectroscopic methodsCD, ORD, NMR & ESRPure enzymeCrystal圖 2.1 酵素純化階段與各種分析方法 目標材之選擇： 何種生物源？ 動

13、物、植物、微生物 何種組織？ 根莖花果或組織培養何種胞器？ 細胞核、液泡、体胞內或胞外酵素？ 水溶性或脂溶性？ B2 酵素純化方法 c. 材貯藏： 材採集後馬上進抽取，是為上上策；但很多情況下，材必須冰凍貯存一段時期後，才進抽取；則應在採集後，儘速置於下 20，能先以液態氮冰凍後貯於 -70則佳。 冰箱的除霜循環，可能對 細胞造成傷害，要特別小心。 解凍時要越快越好，但避免局部過熱。 有些酵素材可乾燥起保存，在無水況下，酵素可免受蛋白脢或水分子晶体的破壞；一般用凍乾燥法，或製成丙酮粉末。 2.3 均質及抽取 a. 打破細胞： 目標酵素在細胞之內，則抽取的第一步驟，就是先打破細胞，有難有。如動物

14、的紅血球，只要改變滲透壓即可脹破，但植物的癒創組織就很堅固，要用海砂用研磨。 有些實驗要使用細胞內的胞器 (organelle) 進，則需以較溫和的方法打開細胞後，再用密心法分各胞器；此步驟難較高，要考文獻多試方法。 b. 打破細胞的方法： 就一般材而言，可能用到的方法舉如下： (1) 乾式： 用加緩衝研磨液，直接研磨成乾粉。 液態氮研磨： 材在液態氮中凍結，以研砵打碎材後研磨成粉。 磨粉機： 似果汁機，原本使用在乾磨中藥藥材。 球磨機 (ball mill)： 以小球增加研磨面積，多用在研磨酵母菌粉。 (2) 溼式： 要在低溫下研磨。 均質器： 玻璃或鐵氟材質，是較溫和的研磨方法。 果汁機

15、(Waring blender)： 每打一分鐘，要間歇分鐘溫，重複進次。 Polytron： 高速電動研磨機，效極高，目前最常用的均質器。 研砵： 磨成細粉後的材，再加入海砂或玻璃砂助磨；傳統而實用。 玻璃球 (glass bead) 以很細的玻璃球混在樣本中，用振盪 ，可打破酵母菌。 超音波震盪 (ultrasonication)： 以超音波打破細胞，多用在微生物材。 French press： 將樣本加壓快速通過細孔，以剪破壞細胞。 c. 提高抽出 ECX 2005 113 分性的酵素，多散佈在材中，只要研磨均勻，大多可抽取得到。 但在均質前，通常要把材先成碎片 (增大表面積) ，才容進抽取。 很多情況下，要先以磨粉機或果汁機打碎，否則抽出會很高。 材亦可以液態氮急速卻，則組織變得很脆，可以磨得很細，提高抽出，且可防止酵素活性喪失。 注意有些材能研磨過，以免細胞破得太碎。 B2 酵素純