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1、单核苷酸多态性检测技术,内容简介,SNP 概 念,SNP 的概念,单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的 改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一 条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷 酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。 它包括单碱基的转换, 颠换、 插入及缺失等形式,SNP在基因组内的形式:,一是遍布于基因组的大量单碱基变异; 二是分布在基因编码区(coding region) , 称其 为cSNP，属功能性突变。 SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的： （1）非转录序列要多于转录序列
2、 （2）在转录区非同义突变的频率, 比其他方式突变的频率低得多。,SNP 的特点,在遗传学分析中, SNP 作为一类遗传标记得以广泛 应用, 主要源于这几个特点: （1）密度高 SNP在人类基因组的平均密度估计 为 11000 bp , 在整个基因组的分布达 3106个, 遗传距离为 23cM , 密度比微卫星标记更高, 可以 在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标 记。 （2）富有代表性 某些位于基因内部的SNP 有可 能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代 表疾病遗传机理中的某些作用因素。,SNP 的特点,（3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标 记相比, SNP
3、具有更高的遗传稳定性。 （4）易实现分析的自动化 SNP标记在人群中 只有两种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个 “ + - ”或“全无”的方式，而无须象检测限制性片 段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测 量，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动 化。,一、 SNPs经典检测方法,一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如: 1 . 限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP ; 2 .单链构象多态性法 PCR- SSCP ; 3 . 变性梯度凝胶电泳 ( dena t ur i ng gradient gel eletrophoresi s DGGE ); 4 .
4、等位基因特异性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等,PCR-RFLP方法,原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性， 用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片 断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位 点。 特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该 限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的 方法之一.,PCR-RFLP原理图,单链构象多态性(SSCP),原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基
5、的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。 特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。,变性梯度凝胶电泳（DGGE）,原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温 度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开 的电泳技术。 电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分 子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到 达该DNA 变性浓度位置时, 使得DN
6、A 双链开始 分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电 场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。 由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其 变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条 带。,等位基因特异 PCR ( AS-PCR),原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特 异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) , 另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS- PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引 物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没 有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增 产物的有无,从而确定基因型的 SNP。,
7、SNPs高通量的检测方法,另一大类检测方法是近些年来发展起来的, 高通 量、 自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用 的有: 1 . DNA测序法; 2 . DNA芯片检测; 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 4 . 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法等等,DNA测序法,直接测序是最容易实施的SNP检测方法。 原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测 序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检 出率可达100%。 特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分 型所需要的重要参数。,基因芯片技术( Genechips),原理:是将具有特定
8、碱基序列的探针固定在特殊的 载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好 的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出 待测序列的碱基类别。 特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的 突出优点。但它也存在若干问题: 芯片造价高昂, 所 需设备贵重, 不利于普及应用。,MALDI-TOF,原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上 的化合物共价结合后, 在硅芯片上进行引物的退火, 延伸反应, 突变部位配对的碱基与正常配对的碱基 不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基 的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。,变性高效液相色谱( DHPLC),原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变
9、性后，含有突变 碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异 源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同 源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来, 从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰 形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的 碱基。 特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差, 不能检测出纯合突变。,MassARRAY,SNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术 是Sequenom公司推出的世界
10、上领先的基因分析工具，通过 引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱技术相 结合，实现基因分型检测。 基于MassARRAY 分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术 可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非 常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对全基因组研究发 现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的 情况。,MassARRAY技术原理:,先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列 特异延伸引物，在 SNP 位点上，延伸 1个碱基。将 制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的 真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离 子，电场中离子飞行时间与
11、离子质量成反比，通过 检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分 析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。,MassARRAY技术原理:,MassEXTEND单碱基延伸反应，紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。,MassARRAY技术流程：,应用：,1. 确定基因多态性和疾病的关系 2. 解释个体间的表型差异对疾病的易感程度 3. 对未来疾病做出诊断 4. 研究不同基因型个体对药物反应的差
12、异，指导药物开发及临床合理用药 5. 个体间SNP千差万别，通过SNP检测等技术进行法医鉴定及个体识别,优势,（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低； （2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来； （3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔； （4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器； （5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应； （6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左右），此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说的4重反应； （7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。 （8）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。,
