离体培养下的遗传与变异

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1、第三章 离体培养下的遗传与变异,Larkin和Scowcroft（1981）提出把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones），而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。,从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包含了双重性：遗传稳定性和变异性。 对于单纯的繁殖技术而言，离体培养的技术操作是细胞或组织或个体的不断复制。然而因为起始培养的材料、培养基成分以及培养时间的不同，使其产生的无性后代的遗传稳定性也有了一定差异，这些变异是因为在培养过程中产生的，属于随机性变异。 细胞工程还有一类技术操作，其目的就在于创造

2、变异，如体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合等。这些离体操作技术，在某种程度上说具有一定的目的性和方向性，可以在短期内获得从自然界可能要经过几年乃至上百年的进化才能获得的性状，从而加速了生物进化的进程。,离体培养中的遗传与变异特点,体细胞变异的细胞遗传学基础,体细胞无性系变异诱导与选择应用,体细胞变异的分子遗传学基础,1 离体培养中的 遗传稳定性,2 离体培养下变异,3 影响体细胞遗传与变异的因素,第一节 离体培养中的遗传与变异特点,一. 离体培养中的遗传稳定性,离体培养的细胞学基础是有丝分裂，有丝分裂的DNA半保留复制和染色体的均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性

3、。 在准确选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性（Phillip等，1994）。正是基于这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。,离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是即使发生某些变异，只需根据需要选择适当的培养方式进行离体繁殖，即可以淘汰或选择变异、或分离纯合体。 离体培养下的变异均属于无性变异，即使变异发生，从个体的角度讲只会发生在少数性状上，因此，很容易从群体中剔除变异个体，从而可以维持离体培养群体的遗传稳定性。快速繁殖即是采用这一技术途径来保持所繁殖对象的品种典型性。 变异也可以通过离体培养选择保留并快速纯化，这亦是离体培养遗传稳定性利用的途径之一。

4、,二. 离体培养下变异特点,变异的普遍性,变异的局限性 （特点）,嵌合性,部分植物离体培养再生植株的表型变异频率,就单个变异体来讲，离体培养中变异性状往往是单一的，或少数几个性状的变异。 分析水稻种子愈伤组织起源的植株变异显示，在来自75个愈伤组织的1121个再生植株中，发生变异的植株，与供体品种比较只有1个性状表现差异的占72，2个以上性状表现差异的只占28。,然而就同一培养体系的再生群体而言，变异又具有多样性 。 黑云杉(shan)（P. mariana）65个系的7047个体细胞胚植株和白云杉（P. glauca）22个系的3995个体细胞植株的表型变异分析显示，尽管两个种的体细胞胚植株

5、变异频率分别只有1.0%和1.6%，但分析发生变异的植株变异范围确较大，按形态变异即可分为9类，仅在矮化型变异一个性状上也表现出一系列程度上的显著不同，生长45年后其植株高度呈现一系列变异类型，一些极度生长限制型矮化的株高只有几厘米，最矮类型的株高只有23cm，,与有性重组相比，体细胞突变性状具有一定局限性 从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。 从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。 一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。,嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是

6、组织培养中常见的现象。 实际上，愈伤组织在大多数情况下是一种具有不同染色体数和遗传变异程度不同的细胞组成的嵌合体，这些细胞各自进行不同步的分裂。,硬粒小麦(Triticum durum )6个无性系植株体细胞染色体数 (括号外为个体数，括号内为染色体数),影响体细胞遗传与变异的因素,供体植物,培养基和培养方式,继代培养的次数,供体植物的遗传背景对体细胞变异具有直接影响。供体植株原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中起着重要作用，处于二倍体水平上的细胞比处于单倍体水平上的细胞较为稳定。 植物种内基因型间变异频率差异较大。 Tremblay等（1999）比较研究黑云杉和白云杉体细胞变异时也显示，黑云

7、杉中体细胞变异频率最大的基因型可达57.6，而有些基因型变异率则为0。白云杉种内不同基因型的体细胞变异，变异率最高的基因型可达42.6，而有些基因型则根本不发生变异。,谷子体细胞无性系R2的变异频率,以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体植物的典型性，体细胞变异频率很低。 在分化组织中，由于细胞分化过程中的核内有丝分裂或核内复制，其结果是在活体内组织分化期间就会出现体细胞多倍性。在植物体内，这些多倍性细胞在正常情况下不再发生分裂以维持正常分化细胞的功能，然而在离体培养条件下，培养基中的激素以及培养环境，就有可能刺激这些多倍性细胞分裂，进而分化形成多倍体植株。,普遍认为，培养方式、激素以及

8、其它附加成分均会诱导体细胞变异的发生，因为离体培养本身可能即是一种变异诱导的过程。 培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定影响。 在豌豆根段培养物和细胞培养中发现， 2，4D 0.25 mgL-1能增加多倍体细胞的有丝分裂，减少二倍体细胞的有丝分裂，而高浓度（20 mgL-1）则能促进二倍体细胞的分裂。 在0.02 mgL-1激动素和1 mgL-1NAA的培养基上建立起来的纤细单冠菊幼苗愈伤组织，保存80天以后，其中多数细胞为二倍体，少数为四倍体。将这些愈伤组织转移到含不同激素水平的培养基上，发现其多倍体细胞的分裂频率不同。0.02 mgL-1激动素和4 mgL-1 NAA的

9、多倍体分裂频率为20，而0.02 mgL-1激动素和1 mgL-1 NAA时的多倍体分裂频率为100。出现这一现象的原因可能是因为多倍体细胞通常具有较强的环境忍耐能力，能够通过一些自体调节使细胞分裂。,激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。首次报道培养过程中的染色体减数是在1948年（Huskins，1948），以后一些研究者在他们的工作中也相继发现这一现象，但有关体细胞倍性减数的资料还十分有限。顾蔚（1999）在蚕豆组织培养中发现，体细胞染色体减数与使用极端的激素浓度有关，在他的试验中不含激素的培养基其多倍体发生频率为6.31，在10 mgL-1NNA和2.

10、5 mgL-1KT的培养基中，单倍体发生频率可达13.03。,除了培养基的外源激素可以引起变异外，培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。,原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异。在细胞培养中，性细胞培养再生植株的变异要大于体细胞培养的植株。马铃薯原生质体培养再生植株的变异达到100，而茎尖培养再生植株基本没有变异。 在因培养类型引起的变异中，不仅有染色体倍性的异常变异，同时基因突变、染色体结构变异、以及非DNA水平引起的变异亦相继增加。,由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种类型的植物中

11、均有报道。一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的机率就越高。 烟草继代培养5年的愈伤组织，其再生植株与供体基因型相比，几乎没有形态正常的植株。染色体分析显示，这些植株大多为非整倍体和多倍体。 玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形态上与供体基因型基本一致，但培养3年后愈伤组织的再生能力显著下降，再生植株生长异常，细胞学分析显示出染色体断裂和带型变异。,培养时间对掌叶半夏愈伤组织染色体变异的影响,第二节 体细胞变异的细胞遗传学基础,离体培养的体细胞变异，从本质上来说是细胞对环境压力的应答机制的调整。有学者认为，实现这一机制调整的始发点是放弃自然条件下的细胞学控制程序，重建新的细胞学控

12、制程序，这种程序重建的结果导致了染色体数量和结构的改变（Phillips等，1994）。,DNA 重复复制,染色体断裂与重组,非正常有丝分裂,一.DNA核内重复复制(endoreduplication）,DNA重复复制但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生，细胞内DNA含量就会不断上升。 Salon和Earle（1998）在硬粒小麦(Tripsacum dactyloides)的非成熟胚培养中观察到，存活的再生植株均为二倍体和四倍体，加倍后的植株在形态和发育方面均很正常。 DNA的核内再复制在有些情况下可以反复进行。 DAmato等（1980）

13、报道，红花菜豆（Phaseolus coecineu，2n22）幼胚离体培养形成的愈伤组织，正常二倍体细胞只占二分之一，由于DNA核内多次复制，有的细胞核内DNA值达到128c。 一些中间类型的倍数性的形成，有研究认为可能是由于DNA经过重复复制后，在以后的复制中出现非同步复制或核融合所致。如第一次DNA复制没有发生分裂的4n核，在此后的分裂进程中，与正常分裂的2n核发生融合，从而形成六倍体（张冬生，1989）。,硬粒小麦中胚轴培养中DNA值的变化,近年研究显示，DNA核内重复复制的发生与细胞分裂周期的调控有关。在离体条件下，一些进入S期的细胞，在完成DNA复制后不进入下一阶段完成分裂，从而使

14、细胞内DNA值和染色体倍性增加一倍。这种细胞进入间期后又开始DNA合成，如果分裂能正常进行，则由此而产生的细胞即为四倍体。如果分裂仍然不能进行，则DNA值和染色体倍性就会再增加一倍，从而使细胞内DNA值和染色体倍性成2n形式增加。 玉米胚乳和子叶发育研究显示，DNA重复复制可能与M期的不同CDK活性有关，而此时的CDK活性又受到磷酸化和去磷酸化的影响。同时，在玉米中还发现了CDK的抑制子CKI，DNA核内复制通过CDK的调控在动物发育和病理细胞中已被证实。因此，Larkins等认为，这一机制可能是DNA核内重复复制的重要调控途径。,拟南芥髓组织、成熟叶片以及托叶细胞多倍体发生过程的研究显示，一

15、个在G2期表达的CDK基因CKS1At参与调节了DNA重复复制过程（Jacqmard等，1999）。此外，Cebolla等（1999）在他们的研究中发现，一个与Cyclins降解有关的基因ccs52也与DNA重复复制和多倍体细胞产生有关。现有资料显示，DNA的核内重复复制可能涉及到一些与细胞周期调控基因的开启与关闭。,二. 染色体断裂与重组,染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的

16、结构变异。,染色体桥,落后染色体,近年的研究认为，染色体断裂与DNA甲基化程度有关。增加DNA甲基化，亦会引起染色体断裂。分析认为，甲基化程度的增加可能抑制DNA的复制效率，使得DNA复制不能同步，从而造成后期桥的产生和染色体的断裂。 染色体结构变异既可发生在愈伤组织细胞中，也可发生在再生植株中，有时在一些再生植株的有性后代中也能观察到。 产生染色体结构变异的再生植株一般生长不正常，生活力低下，很难长期生存，因此以保存种质资源为目的的离体培养应尽可能避免这种变异发生，以免造成基因资源流失。,三. 非正常有丝分裂,离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖遗传稳定差。,纺锤体形成异常使得有丝分裂不正常是其原因之一。,核裂经常导致双核与多核细胞的出现。在红花菜豆的胚培养愈伤组织中，双核细胞有70有核裂现象，蚕豆子叶诱导的愈伤组织细胞的双核和多核细胞出现的频率也相当高。在核裂出现频率高的材料中，多倍体、亚多倍体和非整倍体细胞的出现频率亦