的损伤修复教学

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1、第十三章 DNA的损伤修复,第一节 DNA损伤 第二节 DNA修复 第三节 基因突变,第一节 DNA的损伤,DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA分子的完整性对细胞至关重要。 在细胞中能进行修复的生物大分子也就只有DNA。 在生物进化中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象。,1.自发性损伤 1.1 DNA复制中的错误 碱基配对的错误频率约为10-4-10-5； DNA聚合酶本身具有校对作用：将不正确插入的核苷酸切除掉，重新加上正确的核苷酸。这样，每掺入一个核苷酸，发生错误的机会有10-8-10-10。,1.2 碱基的自发性化学变化 a. 碱基的异构互变 DNA中的4种碱

2、基各自的异构体间自发地相互变化(例如烯醇式与酮式碱基间的互变)，使碱基配对间的氢键改变。,异构体间自发地相互变化形成导致下一世代中GC配对取代AT配对。,腺嘌呤的稀有互变异体与胞嘧啶,胸腺嘧啶的稀有互变异构体与鸟嘌呤,b.碱基的脱氨基(deamination)作用 碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤会变成黄嘌呤(X)等。 胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。,c.脱嘌呤（depurination）与脱嘧啶 自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来。 一个哺乳类细胞37，20h内DNA链自发脱落的嘌呤约1000个

3、、嘧啶约500个， 长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞(如神经细胞)在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，约占细胞DNA中总嘌呤数的3%。,d.碱基修饰与链断裂 细胞呼吸的副产物O2、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，引起DNA单链断裂等损伤 每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次。 DNA的甲基化、结构的其他变化等，这些损伤的积累可能导致老化。,2. 物理因素引起的DNA损伤 2.1 紫外线引起的DNA损伤 紫外线照射，同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环(cyclobutane ri

4、ng)连成二聚体。,图 胸腺嘧啶二聚体的形成,人皮肤因受紫外线照射而形成二聚体的频率可达每小时5104/细胞，只局限在皮肤中。 微生物受紫外线照射后，会影响其生存。 紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。,2.2 电离辐射引起的DNA损伤 直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤， 间接效应是指DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。 电离辐射可导致DNA分子的多种变化： a.碱基变化 主要是由OH-自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。 一般嘧啶比嘌呤更敏感。,b.脱氧核糖变化 脱氧核糖上的每个碳原子

5、和羟基上的氢都能与OH-反应，导致脱氧核糖分解，引起DNA链断裂。 c.DNA链断裂 射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开。 单链断裂(single strand broken)， 双链断裂(double strand broken)。 单链断裂发生频率为双链断裂的10-20倍，但比较容易修复；对单倍体细胞来说(如细菌)一次双链断裂就是致死事件。,d.交联 DNA链交联：同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间可以共价键结合， DNA-蛋白质交联：组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA共价键连接。 3.化学因素引起的DNA损伤 突变剂或致癌剂

6、对DNA的作用。 3.1 烷化剂对DNA的损伤 是一类亲电子的化合物，很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应。 烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤：,a.碱基烷基化 烷化剂如甲基黄酸乙脂（EMS）,氮芥(NM),甲基黄酸甲脂（MMS）,亚硝基胍（NG）等，它们的作用是使碱基烷基化，将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上； EMS使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的O-6-E-G和 O-4-E-T分别和T、G配对，导致GC对转换成AT对；TA对转换成CG,b.碱基脱落 烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变。 c.

7、断链 DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷化，形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。 ,d.交联 烷化剂有两类: 单功能基烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只能使一个位点烷基化； 双功能基烷化剂，化学武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等，某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类，其两个功能基可同时使两处烷基化，结果就能造成DNA链内、DNA链间，以及DNA与蛋白质间的交联。,图3 氮芥引起DNA分子两条链在鸟嘌呤上的交联 (a)交联附近的总图；(b)交联部分结构图,3.2 碱基类似物对DNA的损伤 人工合成的一些碱基类似物，用作促突变剂或抗癌药物，如5-

8、溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、2-氨基腺嘌呤(2-AP)等。 其结构与正常的碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成。,其它诱发突变的化学物质或致癌剂： 例如亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T； 羟胺能使T变成C，结果是A-T改成C-G； 黄曲霉素B也能专一攻击DNA上的碱基导致序列的变化。,第二节 DNA修复,DNA修复(DNA repairing)是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能； 有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继

9、续生存。 修复系统： 切除修复 回复修复 错配修复 SOS修复 重组修复 限制修饰系统-对付外源DNA的入侵,1 切除修复(excision repair) 对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂、交联等都能起修复作用。 这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。 需要多种酶作用，复制前进行 。 1.1 核苷酸切除修复 1.1.1 大肠杆菌核苷酸切除修复有关的酶 1） UvrABC内切酶或切除酶： 需要ATP的结合但不需要ATP水解； 是uvrA，uvrB和uvrC三个基因表达产物的复合物； 在损伤位置两侧各作一缺口（Uvr

10、B在3端，UvrC在5端）。,2）解链酶（UvrD编码）： 去除UvrABC内切酶产生的寡核苷酸； 3）DNA聚合酶(DNA pol) 4）DNA连接酶(DNA Ligase) 人类核苷酸切除修复有关的基因: （XPA，XPB，XPC，XPD，XPF，XPG）缺陷 引起人类着色性干皮病。 临床表现 ：严重光敏感，皮癌，视力缺陷，神经错乱。,1.1.2 核苷酸切除修复过程,Uvr系统在修复各阶段中的作用： UvrA识别损伤； UvrBC在DNA上切一缺口； UvrD解旋切口区域的DNA,并释放出切割的DNA片段。,1.2 碱基切除修复 1.2.1 碱基切除修复有关的酶 1) DNA糖基化酶（DN

11、A glycosylase): 识别DNA中损伤的或错误的碱基；水解N-糖苷键去除碱基。 2) AP内切酶（Endonucleases） ： 有35外切酶活性，切除AP位点5端的数个核苷酸。 DNA糖基化酶去除碱基后，产生一个AP位点。 AP内切酶识别此位点并在AP位点的5端产生一个切口。 3) 脱氧核糖磷酸二酯酶（dRpase）： 切除AP位点的脱氧核糖磷酸，产生一个核苷酸的缺口。 4) DNA聚合酶： 在缺口处进行修复，加入一个核苷酸。在AP位点5端进行广泛的修复合成。 5) DNA连接酶：连接最后一个切口。,烷化碱基,切除的游离碱基,无嘌呤嘧啶位点,碱基切除修复过程,基本步骤： 首先由核

12、酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5侧切开磷酸二酯键。 由53核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。 在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按53方向DNA链，填补已切除的空隙。 由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。 最终使DNA恢复原来的结构。,DNA损伤后切除修复,2 回复修复/直接修复(direct repair) 指无需去除碱基或核苷酸，只需一种酶经一步反应修复DNA损伤的修复机制。 较简单的修复方式，一般都能将DNA修复到原样。 2.1 烷基的转移 O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)，能直接将DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到酶的半胱氨酸残基上而修

13、复损伤的DNA。 这个酶的修复能力并不很强，但在低剂量烷化剂作用下此酶有修复活性。,2.2 光修复,由细菌中的DNA光解酶(photolyase)完成： 此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光； 结合后如受300600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。,2.3 单链断裂的重接 DNA单链断裂，其中一部分可仅由DNA连接酶(ligase)参与而完全修复。 双链断裂几乎不能修复。 2.4 碱基的直接插入 DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶(inse

14、rtase)识别结合，在K+存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入，生成糖苷键； 所催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使DNA完全恢复。 ,3 错配修复（mismatch repair） 一种纠正复制后子链中错配碱基的修复方式。 3.1 错配修复有关的蛋白和酶 MutS蛋白：识别错配的碱基。 MutH蛋白：内切酶，在子链未甲基化的5-GATC-3序列靠近鸟嘌呤的5-端造成一个切口，使包括错配碱基在内的数百个核苷酸得以切除。 MutL蛋白：将MutH和MutS蛋白连接成复合体。 解链酶：解开DNA双链。 单链结合蛋白：稳定单链模板。 DNA聚合酶：从3-OH填补空缺。

15、 DNA 连接酶：连接切口。,3.2 DNA错配修复的模型,MutS,MutL,MutS,MutH,MutS识别错配位点,并易位到GATC位点。 MutH在GATC位点剪切非甲基化链，内切酶从GATC到错配位点降解DNA。,3.3 错配修复的意义 修复DNA复制过程中逃避了DNA聚合酶校正作用的子链上的错配碱基。在子链合成后几分钟之内，GATC尚未甲基化，故能被MutH蛋白识别，结合并制造切口。 人类遗传性非多发性结直肠癌的病因是错配修复的基因缺陷。,mMLH1 突变谱 外显子 基因突变 蛋白产物（预测） 16 165bp缺失 外显子缺失16阅读框内 19 46bp缺失 移码，氨基酸替换 19

16、 46bp插入 羧基末端延长 12 371bp缺失 移码，不完整蛋白质,4 重组修复(recombinational repair)复制后修复 指由基因的同源重组介导的修复过程。 在某些情况下没有互补链可以直接利用，例如在DNA复制时两条链已经分开后发生DNA损伤，采用重组修复。 作用： （1）修复DNA复制时子链的缺口。 （2）修复双链断裂，单链缺口。 （3）修复双链交联。,修复步聚： 受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。 另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口。 以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。,DNA重