《的复制和修复》ppt课件

《《的复制和修复》ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《的复制和修复》ppt课件（80页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第十三章 DNA的复制和修复,1958年，F.Crick提出中心法则,揭示了生物体内遗传信息的传递方向： （1）以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程。 （2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。 （3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。,DNA生物合成：DNA复制和反转录 DNA的体外复制：分子克隆（PCR）。,第一节 DNA的复制 一、 DNA半保留复制机制 1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。 P321 图191 Watson和Crick提出的DNA双螺旋

2、复制模型 1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli. DNA，用密度梯度离心试验证明了DNA的复制是半保留复制。 P322 图19-2 DNA的半保留复制。,1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E. coli. 染色体DNA。 P323 图 19-3,二、 复制起点、单位和方向 DNA的复制是在起始阶段进行控制的。 1、 复制起点 复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。 有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。 多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含A.

3、T。,环状DNA复制起点的gene mapping P325 图19-6,复制起点的克隆和功能分析重组质粒转化法 大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有1-2个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到20以上，这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。 鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp的DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中

4、亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。 起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。,2、 复制单位 复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是都是环状双链分子，都是单复制子。 真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。 病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。,3、 复制方向 复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。,用放射自显

5、影实验判断DNA的复制方向及速度 P325 图19-17 单向和双向复制的放射自显影证明 a. 单向 b. 双向等速 c. 双向异速,4、 DNA的几种复制方式 （1）、 直线双向复制 单点，T7 多点，真核染色体DNA （2）、型复制：环状双链DNA，单向或双向（E .coli.） （3）、 滚环复制：环状单链DNA，x174 （4）、 D环复制：线粒体、叶绿体DNA 不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。,（5）、 多复制叉复制： 第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复

6、制。 DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实际上取决于起始频率。 E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟4.2X106/（50KbX2）=42。富营养时，可采取多复制叉复制方式，20min复制一代。 真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子方式，真核染色体复制一代要6-8小时。,三、 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子 （一） DNA聚合酶和DNA的聚合反应 1、 DNA聚合反应必备的条件 DNA聚合酶 DNA模板(反转录时用RNA模板) 引物 (DNA、RNA) 4种dNTP Mg2+,2、 聚合反应过程及特点 总反应式

7、： P329 图19-10 P330图19-11,DNA聚合酶的反应特点： 以4种dNTP为底物 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。 反应需有引物3，-羟基存在 链生长方向5， 3， 产物DNA的性质与模板相同,DNA生物合成53， 化学合成35,3、 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型 P331图19-12 （1） 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3羟基端回折成引物链。 （2） 末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3末端突出作为模板。 （3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。 （4） 环形聚合：加入带引物的环形DN

8、A作为模板。,4、 E.coli DNA聚合酶 （1）、E.coli. DNA pol. I（Kornberg酶，400 copy/cell） 单体酶，催化活性： 5， 3， 聚合活性 3， 5， 外切活性 5， 3， 外切活性 用蛋白水解酶将DNA pol.部分水解可得： 大片段（Klenow）：5， 3，聚合活性、3， 5，外切活性。 小片段，36Kd，活性：5， 3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。 Klenow片段的用途： a 补齐DNA 3，隐缩未端 b. 标记DNA片段未端 ccDNA合成第二链 dd DNA测序,（2）、 E.coli. DNA Pol.（

9、100 copy/cell） 单体酶，催化活性： 5， 3，聚合(活性很低) 3， 5，外切 可能在DNA的修复中起某中作用。 （3）、E.coli.DNA pol.（复制酶，10-20 copy/cell） 寡聚酶。 P334表10-3 DNA pol.是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase),P334 表19-2 E.coli三种DNA聚合酶的性质比较 DNA聚合酶III有6个结合位点 模板DNA结合位点 引物结合位点 引物3，-OH位点、反应位点 底物dNTP结合位点 5， 3， 外切位点 3， 5， 外切位点(校正),5、 真核生物DNA聚合酶 P334 表19-4

10、真核生物DNA聚合酶 DNA聚合酶：多亚基，是真核DNA的复制酶。 DNA聚合酶：主要在DNA损伤的修复中起作用。 DNA聚合酶：从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。 DNA聚合酶，特点：有3， 5，外切活力,（二） 引物酶或RNA聚合酶（引发酶） 可合成6-10个碱基的RNA引物。 DNA复制为什么要用引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？） P338 从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配 新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，3，校对功能难发挥作用。,（三）、 解螺旋酶 大肠杆菌的解螺旋酶、与rep蛋白共同作

11、用，将DNA两条链解开。 解螺旋酶I、II、III沿着模板链的53方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿35方向移动。,（四） DNA旋转酶 属DNA拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。 拓扑异构酶使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。,（五） 单链DNA结合蛋白（SSB） 复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保

12、护单链DNA不被核酸酶降解。,（六） DNA连接酶（ligase） 连接双链DNA上的切口。 大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。 T4DNA ligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。 （七） DNA复制的拓扑结构 P338-339,四、 DNA的半不连续复制方式 P336 图19-15 DNA的半不连续复制 前导链： 滞后链： 1968年，发现冈崎片段。长度： 细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。 真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度。,五、 DNA复制过程（E.coli.） P342 图19-17 大肠杆菌的复制体结构示意图,1

13、、 复制的起始 引发：DNA的双螺旋解开合成RNA引物的过程。 引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、nnI）构成的复合体，负责RNA引物的合成。 引发体沿着模板链35方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。,大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质： DNaA 在原点处打开双螺旋 DNaB 使DNA解旋 DNaC DNaB结合在原点所需 Hu 刺激起始 引物酶（DNaG） 合成RNA引物 SSB 结合单链DNA RNA聚合酶 促进DNaA活性 旋转酶 松驰DNA扭曲应力,2、 DNA链的延长反应 链的延长反应

14、由DNA pol.催化。 复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。,3、 RNA引物的切除及缺口补齐 DNA pol的5， 3，外切活力，切除RNA引物。 DNApol的5， 3，合成活性补齐缺口。 4、 DNA切口的连接 DNA ligase。 5、 DNA合成的终止 环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。, 小结： DNA解螺旋酶解开双链DNA。 SSB结合于DNA单链。 DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 D

15、NA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。 DNA pol.在两条新生链上合成DNA。 DNA pol切除RNA引物，并补上DNA。 DNA ligase连接一个冈崎片段。 DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA pol、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。,六、 真核生物DNA的复制 P343 1、 复制起点和单位 真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体DNA（单复制子）小得多。 试验证据：5-氟脱氧胞苷标记,真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢。 原核生物快速生长时，采用多复制叉复制。 真核生物快速生长时，采用多起点复制。,2、 真核复制过程中组蛋白的装配 真核复制过程中DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。 组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。 试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察,3、 真核生物DNA复制的终止 端粒（telomeres） ：是真核细胞染色体末端所特有的结构，一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，。