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1、,第三章 酶的分离纯化,本章重点,各种分离方法的操作原理 分离方法的应用原则 酶分离纯化中应注意的问题,酶制剂的来源,3.1 酶纯化的必要性 3.2 起始材料的选择 3.3 酶的萃取 3.4 分离方法 3.5 酶纯化步骤的设计 3.6 纯化步骤的定量评价 3.7 在纯化过程中酶活力的损失,3.1 酶纯化的必要性,生物细胞中同时存在多种多样的酶。 酶在生物细胞中的分布并不是均一的。 许多酶可能作用于同一个底物。,某种酶的纯化程度根据研究目的而定。,3.2 起始材料的选择,不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。 微生物培养物 注意材料的年龄 注意在生物体内的富集区域,3.3 酶的萃取,（处理液应
2、及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。） （1）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞外酶的测定） （2）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料 缓冲液(pH 7.5)的作用，中和从空泡中放出的大量酸；高离子强度(0.1-0.5)有助于将酶从结合的膜上解析下来；丙酮粉有助于将酶与脂肪或磷脂膜分离。 注意事项：蛋白酶的抑制方法（低温快速、抑制剂） 制备丙酮粉用以解除酶与脂肪或磷脂膜的结合。 除去核酸：调整pH沉淀（鱼精蛋白硫酸盐或链霉素）、水解,3.4 酶的分离方法,（1）以大小或质量为依据：离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰胺
3、）、透析、超过滤 （2）以电荷为依据：离子交换色谱（低离子强度、适当pH）Sephadex、DEAE-纤维素、CM-纤维素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置）,（3）以溶解度变化为依据：改变pH、改变离子强度、降低介电常数 （4）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗提 （5）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩,分离方法分解,(1)以大小或质量为依据,离心 凝胶过滤 透析和超过滤,1.1 离心,原理：以质量不同为分离依据 离心力5000-50
4、000g 处理量可达几升 分离对象:细胞碎片、沉淀下来的酶,高速离心 速度一般在20,000以下。 超离心 相对离心力场速度在75,000 g以上，在80,000250,000 g 之间。主要分离小分子量酶。 沉降速度, 离心法（区带离心法），等密度梯度离心法（沉降平衡法）。,1.2 凝胶过滤,原理：不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同，能进入微孔的小分子被阻滞，不能进入微孔的大分子未被阻滞。 换句话说，分离是因为不同分子在进入或不进入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的。 其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析,Sephadex(交联葡聚糖）、Bio-Gel(交联聚丙烯酰胺）
5、酶后期处理（小量试样）,葡聚糖凝胶操作流程： 1）选择 根据分子量大小范围选择凝胶。 凝胶 如:G50排阻1,500-30,000 （Sephadex） 还有粗，中，细分，细的分辩率高,流速慢；粗的分辩率低,流速快。 2）溶涨 水浸或沸水煮，快而可以杀菌，防止微生物污染。 3）装柱 不能有气泡，用缓冲液平衡 4）上样 按柱床体积计算约1/ 40左右。 然后用缓冲液洗脱。注意流速。 5）再生 稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微 生物生长，加0.02% NaN3 使用时要注意可能抑制你要分离的酶。,聚丙烯酰胺凝胶 丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合而成。 Bio-Gel P-2 数字后面乘1000表
6、示最高排阻分子量 分离生物大分子的范围与葡聚糖凝胶 基本相同 琼脂糖凝胶 是琼脂去除琼脂胶后得到 D-半乳糖和6-脱水 Sepharose 半乳糖相间排列而成。 如：4B即琼脂糖含量占4% 。 另外的商品Bio-Gel A是琼脂糖与丙烯酰 胺交联而成。Bio-Gel CL，比上述二种 化学稳定性和机械强度更好，应用更大。 作用：浓缩，脱盐等，分级分离,1.3 透析和超过滤,透析膜：带有微孔的筛子 小于等于20000的大分子通过，更大的分子不通过。 除去酶液的盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂 超过滤：在0.29 MPa氮气压力下使酶液透过透析膜。 浓缩酶液,(2)以电荷为依据,离子交换色谱 电泳
7、等电聚焦,2.1 离子交换色谱,取决于带相反电荷基团的静电吸引。 DEAE-纤维素（二乙基氮基乙基-纤维素） 结合带负电荷基团，阴离子交换剂 CM-纤维素（羧甲基-纤维素） 结合带正电荷基团，阳离子交换剂,离子交换纤维素: 是纤维素作为母体，引入相应的交换 基团，蛋白质不容易变性，交换容量大 （0.2-1.0mg/克干胶） 离子交换树脂: 聚苯乙烯树脂引入相应的解离基团， 分阴，阳离子交换树脂。 有强酸， 强碱，弱酸，弱碱。 离子交换凝胶: 葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，导入 相应的交换基团，交换容量更大2.5- 4.5mg/克干胶）,1）离子交换剂选择：考虑酶稳定性需要 酶蛋白在pI的pH条
8、件下稳定 用阳离子交换剂。 酶蛋白在pI的pH条件下稳定 用阴离子交换剂 在pI pH,pI pH条件下稳定 二种交换剂都可用 2）如何选择强型和弱型交换剂 酶蛋白pI在 9 时 考虑用强型离子交换剂 酶蛋白在强型或弱型离子 考虑到酶的不稳定性， 交换剂通用，选弱型。,解吸方法：改变pH（改变结合基团的电荷），提高溶液的离子强度（与酶竞争结合位置） 使用规模可大可小 纯化倍数为10左右,2.2 电泳,原理：在外加电场的影响下，带电分子具有不同的运动速度。 支持介质：纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺 小规模或分析水平，也可在制备水平,2.3 等电聚焦,依据：在pH梯度中的平衡位置。 用两性电解质
9、，多乙烯多胺与丙烯酸的同系多异构体混合物。在电场作用下，形成连续平滑的pH梯度，而酶样品在其中也形成相同的等电点pH梯度。 分辩率高，pI相差0.01 pH的酶与蛋白质可分离 。 注意：在pI附近蛋白质容易沉淀，影响分离的数量和质量。,聚焦层析：兼有等电聚焦灵敏度高和柱层析简便的双重特点。,原理： 用特定的多缓冲液滴定和淋洗层析柱特定的多缓冲交换剂，随着缓冲液的扩展，会自上而下建立pH梯度，而蛋白质也在相应pH梯度处聚焦，随着缓冲液的下移而下移，最后从层析柱中流出来。 关键：选好多缓冲交换剂和多缓冲液。 如：PBE94 阴离子交换剂和 Polypuffer96多缓冲液。,流程:1）选好多缓冲液
10、和多缓冲交换剂 2）调整起始缓冲液pH上限,用平衡的多缓冲交换剂装柱， 3）调整起始缓冲液pH梯度下限,用下限缓冲液510毫升过柱 4）上样品，用这个下限缓冲液洗脱，并分部收集。 5）多缓冲交换剂再生和平衡。 操作 1. PBE118 应用pH范围： pH9以上 PBE94 应用pH范围：pH 96 或 pH 74 2.选pH梯度 已知酶的等电点，选择酶在1/31/2处洗出， 分辩率高，而且省材料和时间。 3.上样量 2030ml柱床体积,可分离200mg蛋白质/pH 4.洗脱液量 一般为10倍柱床体积 5.流速 3040ml / 小时 6.再生和储藏 用1mmol/L NaCl洗涤，0.1N
11、HCl洗，用高pH缓冲 液平衡，放适宜pH的起始缓冲液保存。可以加 24%乙醇，4保存。,快速液相层析（离子交换层析, mono Q ;monoS）： 用于聚焦层析（mono P),（3）以溶解度变化为依据,盐析 有机溶剂沉淀法 选择性沉淀法 共沉淀法 PEG沉淀法、 等电点沉淀法,3.1 改变pH,调整pH至酶的等电点。,原理： 溶解度随分子引力加大而减小，其他条件相同，只pH在等电点附近,分子引力最大，蛋白质就沉淀。 一般不单独使用，配合其他方法使用。,3.2 改变离子强度,盐溶现象：加入离子有助于分散大分子上所带的电荷而使溶解度提高。 盐析：离子强度提高到超过某一数值，带电分子将会沉淀下
12、来。,特点：1. 最古老,但应用广 2. 常用NH4)2SO4，因为溶解度大 0时，(NH4)2SO4溶解706g/L; 25时，(NH4)2SO4溶解767g/L; 在 0时也能把几乎所有的蛋白盐析出来。,最好用分析级盐析 从55%开始有沉淀析出 65%时有50%沉淀 75%时有7080%沉淀 100 蛋 白 质 50 浓 度 0 20 40 60 80 100 % (NH4)2SO4浓度 (以百分饱和度表示),蛋白质浓度,1）小样试验 ： 盐析常数: 由蛋白质性质、盐种类决定 log S=- KI 盐析常数 离子强度 蛋白质溶解度 是蛋白质在纯水中( I = 0 ) S的外推对数值 与蛋白
13、质种类、溶液、温度、pH决定 2）成功的关键 ：pH = 等电点 （pI ） 蛋白质浓度 1000ug/ml, 沉淀快 主要用于分级沉淀，在 0左右进行。 常用(NH4)2SO4 ，溶解度大，T影响小。,操作方式： 常用加饱和(NH4)2SO4溶液或加固体（NH4)2SO4 缺点：脱盐（对浓盐溶液透析），分辨率低。 优点：简便、安全、重复性高。,3.3 改变介电常数,加与水相混的有机溶剂，改变溶液介电常数，增加蛋白质间静电作用力，减弱蛋白质与溶剂分子之间的作用，导致蛋白质聚集而沉淀。另一作用脱水。,有机溶剂沉淀法,1)温度 0下操作。 常用丙酮, 还有甲醇, 乙醇等， 有机溶剂先在-1520下
14、预冷，沉淀后立即在低温下离心分离。 2）pH = pI 3）I 常加510% (NH4)2SO4，以提高分离效果， I 0.05 M 可以提高分辨率和酶稳定性 4) 沉淀后马上用缓冲液溶解，减少有机溶剂浓度。 优点: 分辩率高且易去除，与pI 同时使用，用于酶粗分 缺点：对有机溶剂不稳定的酶，容易变性。,多聚电解质 聚丙烯酸（PAA）等杂多酸，在低浓度时，选择性地与某种（某类）酶络合沉淀。作用机制还不清 PAA + 酶溶液（酶 + 杂蛋白） 溶菌酶，蛋白酶等 （PAA-酶）沉淀 + 杂蛋白（在溶液中） Ca + 酶 在溶液中 + （PAA- Ca +）沉淀 SO42 PAA+ Ca SO42
15、沉淀 成功关键是PAA的分子量,选择性沉淀法,共沉淀法,利用离子聚合物（SDS），非离子聚合物(聚乙二醇，聚乙烯亚胺，单宁酸) 等，在一定条件下与蛋白质直接或间接形成络合物，使蛋白质，酶一起沉淀，再用适当方法把酶溶解下来。,PEI（聚乙烯亚胺） + 菌体超声上清液（酶） 0.2M KCl (DNA)-PEI - 杂蛋白质和酶 ）沉淀 0.6M KCl EcoRI(酶)被溶解下来 + (DNA)-PEI -杂蛋白沉淀， 不溶解,为水溶性非离子型聚合物，方法同(NH4)2SO4, 但与PEG分子量有关系。 优点：PEG对蛋白质活性构象起稳定作用。 缺点：PEG分子量大，溶液粘度大，操作难。 分子量小，用PEG多才能使蛋白质沉淀， PEG用后，要去除； PEG价格很贵，不太用于大量样品。 常用PEG4000，6000。 一般蛋白质浓度在10mg / ml以下，控制pH=p I ，T=20。 PEG以固体或50%液体形式,聚乙二醇（ PEG ）沉淀,以上方法基本上是“固液”分离方法。 “液-液”分离纯化： 酶，杂蛋白都在液相中。 液相包括一相或多相，但不相溶。 K = C上 / C下 分配系数不同 ，酶和蛋白质的介电常数介于0.11.0之间。 优点：比较适合
