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1、课程内容安排,一、融合蛋白 表达载体构建的设计与质粒提取及分析 实验课有关要求及注意事项 分子生物学实验有关基础知识及操作（微量操作，移液器及酶的使用，称量，制板，灭菌等） 基因克隆的原理 蛋白表达载体的构建 细菌培养（液体和固体） 质粒DNA的提取及定量分析 二、重组质粒的构建 DNA酶切，电泳，纯化（讲解PCR产物纯化） DNA的体外连接,三、细胞转化 感受态细胞的制备及转化（CaCl2法，提前过夜摇菌） 四、重组质粒的鉴定（PCR法） 提前转板过夜 PCR原理，反应条件及PCR引物设计（软件操作） 重组转化子的鉴定PCR法（介绍Cracking gel等方法） 重组转化者的保存（-70）
2、 五、体外重组蛋白表达及分析 提前IPTG诱导 SDS-PAGE胶 Brand ford 蛋白定量分析 蛋白纯化及活性测定,六、总RNA的提取及测定 组织总RNA的提取，变性胶鉴定 讲解RT-PCR 七、基因组DNA的提取及鉴定 基因组DNA的提取及鉴定 基因组和cDNA PCR，基因结构分析 八、基因的蛋白水平表达检测（Western blot） Western blot 基因组DNA酶切胶检测 总复习，总结,实验一、融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取分析,第一部分：分子实验相关知识 Part I： 实验课有关要求及注意事项 Part II： 分子生物学实验有关基础操作 Part III：
3、基因克隆的原理 Part IV： 蛋白表达载体的构建,第二部分：质粒DNA的提取及定量分析 Part I： 质粒DNA提取的原理 Part II： 方法步骤 Part III： 结果与分析,分子生物学实验室一般安全知识,不能在实验室吸烟，或吃喝东西。 当使用危险或潜在危险物质时，请穿上工作服，戴上手套，保护眼镜和口罩。 请记住，使用EB，酚等危险物质时，必须戴手套， 并且应该经常水洗手套的外围，以免污染仪器等。当你离开实验室时，务必脱掉手套方可离去。使用同位素及酚时，建议戴两层手套。 废物的处理：废液，强酸及强碱（须稀释）等液体可以倒入水槽，并放水冲走。废纸等固体废物应倒入垃圾桶。废弃的微生物
4、以及培养它们的朔料枪头及管必须倒在指定桶内以备消毒，培养基以及盛其容器必须高压消毒后方可作普通物品处理。同位素实验的废液及物品，则分别倒在同位素室里指定的容器里。EB胶倒在指定桶内。酚及氯仿及盛它们的管分别倒在化学通风厨内的容器内。破碎的玻璃制品必须倒在特定的桶内。,当你使用紫外分析仪时，应戴上防紫外线的眼镜。如果用它来切胶，请戴上面罩。 同位素实验必须在同位素室进行。不得随意将同位素室里的任何仪器搬出来。完成同位素实验后，必须用仪器测定所用物品，桌面及手套等， 肯定没有污染后方可离开同位素室。 如果洒了化学，生物等危险物质，把那区域作一记号，并马上汇报老师，作相应的处理。一般的药品溅出，应马
5、上用吸水纸清洁干净。 如化学物品溅到皮肤等，应马上用水冲洗。如轻微割伤并没感染的话，可用红十字药盒里的止血贴，否则，马上送医院。任何事故应马上报告老师。,量程： 0.510l (读数窗显示0.510.0,精度为0.1l) 550l (读数窗显示5.050.0, 精度为0.5l) 20200l (读数窗显示20200, 精度为1l) 1001000l (读数窗显示1001000, 精度为5l),安装吸头,使用量程配套的吸头 将枪嘴垂直插入吸头盒的吸头上 轻轻用力向下压，同时把手中的移液器按顺时针方向旋转180，使吸头紧紧地扣在枪嘴上。,移液操作,一手拿住枪，另一手旋转转来设置你所要的容量。 把合
6、适的枪头插入枪的末端，并轻微旋转一下。 把活动杆压下一档。这让枪定下你所要的容量。 把枪头直伸入液体约2-5mm深处。如果深入过深， 将使枪头的外围粘上液体而导致取液的误差。 让活动杆慢慢地回到原始位置。否者，过快产生的 气雾将污染枪管和你的溶液。 让枪头在液中停一会，以便使液体完全进入枪头。如果枪头从液中移开太快，可能会有空气在枪头中。应目测是否有气泡或者所取的量是否符合你的要求。 把枪头贴在液面附近的管壁或管底，然后把液体放出。须检查是否还有液体在枪头中，如是，慢慢把液体放入管中。 把枪头去掉，扭回最大量程处。,移液操作tips,吸酶或母液时，永远用新的干净的枪头。如果不幸污染了酶，请报告
7、老师。即使是稀释一梯度溶液，如要求很严格的体积，也必须使用新的头。 检测是否漏气的方法：将吸取液体后的移液器垂直静置 15 秒，观察是否有液滴缓慢 的流出。若有流出，说明有漏气现象。 严禁吸液后将移液器平放！ 对于粘稠液体可首先吸放几次，然后极缓慢地松开按钮，使溶液慢慢进入吸头内；否则，可使吸入体积减少。,移液器的校正,在25时，水的密度大约为1g/ml （mg/ul）. 如要校正2-20ul 移液器，取10和20ul水于分析天平上分别称三次。 如要校正20-200ul 移液器，测量100和200ul的水。 如要校正100-1000ul 移液器，测量500和1000ul的水。 如果你的移液器误
8、差超过了5%，请通知老师。,离心管的使用,手持离心管时注意不要触碰离心管内表面，包括盖子内表面,实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀。 混匀、保温等反应后样品应瞬时离心将内容物收集至管底后再进行下步的实验。 实验过程中应做好每个样品的标记工作，且一般在离心管上用记号笔作标记时，应在两处重复做好标记。,基因克隆（DNA重组）,克 隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化：获取同一拷贝的过程。 DNA克隆（分子克隆、基因克隆、重组DNA ）： 应用酶学方法，在体外将外源性遗传性物质（DNA）与载体结合成重组DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、
9、提取获得大量同一DNA分子的过程。,工具酶,工具酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基 形成二酯键 DNA聚合酶I a.合成cDNA的第二条链b.缺口平移c.测序d.补平 反转录酶 合成cDNA 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化 末端转移酶 同聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,主要来源于原核生物，具有识别自身DNA或异源DNA的功能，通过切割破坏或限制异源DNA分子侵入宿主细胞来保护自身。 识别特性：具有双链对称的回文结构 5 G A A T T C - 3 3 C T T A A G - 5
10、 ,限制性核酸内切酶,命名：H in d III 属 种 株 同一株具不同特异性酶 分类：根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为型、 型和型三类。DNA重组技术中最常用的是型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。 同裂酶（异源同功酶）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。 同尾酶：来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。 BamH、Bcl、 Bgl、Sau3A和Xho就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。,BamH：,Bgl：,目的基因,cDNA：complement
11、ary DNA 经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA。 基因组DNA： 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。 目前获取目的基因的几种途径或来源 化学合成法 用适当方法筛选cDNA或gDNA文库就可以分离到目的基因。 RT-PCR(从mRNA合成cDNA ) 从染色体DNA中分离,载体,载体的分类 按来源：质粒、噬菌体、病毒 按产物：克隆载体、表达载体 按宿主细胞：原核细胞载体、真核细胞载体,供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞； 2.为外源基因提供复制能力或整合能力；3.为外源基因的扩增或表达提供条件。 载体具备条件
12、1.自主稳定复制 2.多克隆位点 3.遗传标记 4.分子量小，插入容量大 5. 细胞内拷贝多 6.安全,1. 细菌质粒 是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。 2. 噬菌体（phage） 噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。用野生型噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA，基因组约为50kb，最常用的哓菌体为DNA及其衍生系列。 3. 黏性质粒（cosmid） 是由质粒与噬菌体DNA组成的一种4-6kb的环状杂种DN
13、A。 表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。,不同类型载体容量,质粒pUC19的分子结构,重组DNA技术的基本流程,1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选 6. 克隆基因的表达,实验流程,Part IV： 蛋白表达载体的构建,克隆基因的表达体系,1原核表达体系 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。 大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制； 用于细菌
14、培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵； 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。 操作方便、快捷，需时较短，表达量大， 适合工业化生产 大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处： 由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA 由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进 行糖基化修饰 表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理 很难表达大量的可溶性蛋白。,克隆基因的表达体系,2真核表达体系 与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细
15、胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA,选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。 主要归结在表达载体的选择上。,一个合格表达载体的组成要素,复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 P/E 启动子/增强子 Terms 终止信号 加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用,pPROEX HT蛋白表达载体,原核表达系统中的各因素,复制子 ：通常
16、情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关 筛选标记和报告基因 ：氨苄青霉素 ，卡那霉素 启动子 ：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一 组成型表达 :组成型启动子 诱导调控型表达 :IPTG 融合表达 ：GST, His-Taq 分泌表达 :信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜 可溶性表达 : 转录终止子 :控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降 核糖体结合位点 :多数载体启动子下游都有SD序列 表达菌株 :不同的表达载体对应有不同的表达菌株,对原核表达载体应该注意3点：, 选择合适的启动子及相应的受体菌； 用于表达真核蛋白质时注意阅读框错位； 根据表达天然蛋白质或融合蛋白来选择相应的表达载体。,GST克隆载体的选择与构建,昆虫谷胱氨肽-S-转移酶基因,pPRO EX-HT载体,体外
