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1、国家基金申请存在 的问题和对策,黎 明 涛 中山大学中山医学院 中山大学蛋白质组学中心,申请书需回答的问题,为什么 立项依据 做什么 研究目标、研究内容 怎么做 研究方案、技术路线 能否做 可行性：工作基础、工作条件,标 题,一个好的标题等于成功一半 确切、醒目、新颖、主题明了 围绕“科学问题” 大小适中，防止“大题目、小课题” 与“科学问题”和“研究目标”呼应,神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控,细胞凋亡 时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控 神经元凋亡时 BH3-only蛋白Bim的转录调控 神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的 调控 SP1对B
2、H3-only蛋白Bim的转录调控 SP1对神经元凋亡的调控作用 关键词：SP1/Bim /基因调控/信号转导/神经元凋亡,标题,摘 要,1. 工作基础 继续和深入 发表和未发表 创新 2. 科学问题 重要！不能缺！中肯 3. 预实验 针对“问题”的预实验结果 4. 工作假设 思想性、创新性 5. 主要方法 可靠性第一 先进性第二 6. 研究目标 明确、具体 7. 研究意义 理论性和应用性,神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控,我们已经证明了撤钾诱导神经元凋亡时JNK/c-Jun 和PI3K/Akt/FKHRL1信号通路不参与BH3only蛋白Bim的上调。 那么，Bim上
3、调的转录机制是什么？启动子5末端序列续减分析确立了诱导Bim表达的启动子核心区，进而发现一个典型的转录因子SP1结合序列位于其中。进一步实验显示：神经元凋亡时SP1被激活；负显性SP1和SP1-DNA结合抑制剂mithramycin A抑制了Bim上调和神经元凋亡。由此，我们首次提出了Bim 上调的新机制，即：神经元凋亡时转录因子SP1被激活，激活的SP1直接调控Bim的诱导表达。本项目拟进一步采用腺病毒表达技术以及启动子定点突变、EMSA和CHIP方法，旨在获得SP1直接调控Bim基因的可靠证据。本项目将阐明SP1对促凋亡蛋白Bim的调控作用和机制、为确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点
4、提供更充分的科学依据。,CaMKII磷酸化GSK-3对去极化介导的神经元存活的调控,GSK-3/GSK-3是促神经元凋亡的重要激酶。研究表明去极化可使GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9发生磷酸化并抑制其活性，从而保护性干预凋亡的发生。但是，去极化时，究竟哪一个激酶介导了GSK-3磷酸化尚不清楚。排除了AKT、PKA、p90RSK的参与后，通过底物一致序列分析和抑制剂实验，我们提出CaMKII介导GSK-3磷酸化的可能性。进一步的体外重组激酶反应分析证明，CaMKII可直接磷酸化GSK-3 Ser21/GSK-3 Ser9。本项目拟采用共免疫沉淀、siRNA和激光共聚焦等方法，旨在获得
5、CaMKII与GSK-3直接相互作用的可靠证据，评价和证实CaMKII磷酸化GSK-3这一事件在去极化促神经元存活效应中的作用。本项目有望揭示去极化调控GSK-3的新机制，为确立GSK-3作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。,立项依据,1. 值得做吗？必要性：意义 价值 思想 创新 2. 谁来做呢？舍我其谁 3. 科学问题？中肯 明确 4. 突出自己的工作 预实验 图文规范化 5. 文献 档次 时效性 自己的文章 规范化 6. 主线清楚 深入浅出 通俗易懂,Fig.6 Mithramycin A, a SP1-DNA binding inhibitor, attenuates
6、bim upreguation by activity deprivation in CGNs. (A) Mithramycin A attenuates the upregulation of BimEL induced by activity deprivation in a dose dependent manner. CGNs were placed in 25K or 5K media in the absence or presence of mithramycin A at the indicated concentrations for 6 h. BimEL expressio
7、n was assessed by Western blot as described in Fig.1(A). Results shown are representative of four separate experiments. (B) Mithramycin A inhibits the increase in bim mRNA level in a dose-dependent manner. Neurons were treated as described in (A), bim and actin mRNAs were determined by RT-PCR, Resul
8、ts shown are representative of five separate experiments. (C) Mithramycin A suppresses the activation of bim promoter induced by activity deprivation. Neurons were co-transfected with bim-Luc and pEF-RL for 8 hr. Luciferase activities were measured as described in Fig.2, The experiments were repeate
9、d three times with duplicates for each treatment. The data represent S.E.M. of three experiments.,参 考 文 献,1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu,Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and Mingtao Li. Activity deprivation-d
10、ependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375：7-12. 2. Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yi
11、fan Han and Mingtao Li. SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinsons disease. Neurosci Res 2004；48:195-202,研究内容、研究目标与 拟解决的关键问题,要求：明确 具体 解决学术问题为目的,研究目标,题目：神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控,实例：获得SP1直接调控bim基因表达的可靠证据，阐明促凋亡蛋白Bim由SP1转录调控的新机制，为确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点
12、提供更充分的科学依据。,研究内容 （围绕研究目标） 1. 证明bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调 为了证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调，将其中的SP1结合序列进行点突变，使其不能结合SP1；确定这一突变是否能够消除bim启动子的撤钾反应。 2. 分析SP1 是否能够与bim启动子核心区的SP1结合序列结合 应用EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)技术，证实bim启动子核心区的SP1 结合序列是否能够与SP1结合；进一步采用CHIP(Chromatin immunoprecipitatio
13、n)方法，获得SP1与bim启动子核心区在细胞内结合的证据。 3. 从 bim 的mRNA 和蛋白质水平，观察负显性SP1是否能够抑制撤钾诱导的bim基因的上调 质粒转染CGNs的转染率只能达到0.1-1.0 %，腺病毒的感染率可达7080%1。 因此，构建dnSP1的腺病毒载体Ad-dnSP1，感染CGNs才能达到可靠分析bim的mRNA和蛋白质表达水平改变的目的。 4. 分析SP1诱导Bim这一机制对神经元凋亡的调控作用 确立SP1转录激活bim这一机制后，进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作用。,项目需求为前提 可靠性第一，先进性第二 参考文献 突出关键技术的描述 不主张使用流程图，建
14、议开头：“有关方法、技术路线、实验手段、关键技术综述如下”,研究方案,基本方法,大鼠小脑颗粒神经元培养、Western blot、RTPCR、钙磷沉淀法转染基因、转基因神经元的凋亡分析、报道基因表达分析、免疫沉淀等基本方法均按我们报道1, 2, 3, 4, 5, 6的进行。,负显性SP1腺病毒(Ad-dnSP1)载体 的构建、扩增、纯化和保存,为了达到在 mRNA 和蛋白质水平（而不仅仅是人工的报道基因水平）观察dnSP1是否能够抑制撤钾诱导bim基因的上调的目的，必须保证dnSP1导入CGNs有较高的导入率。现有质粒转染CGNs方法的转染率只能达到0.1-1.0 %，而在方法得当的情况下（见
15、后）腺病毒的感染率可达7080%1。因此，dnSP1的腺病毒载体Ad-dnSP1的构建是采用RTPCR和Western blot分析bim的mRNA和蛋白质的前提。 腺病毒的扩增和纯化按本人报道的进行1。腺病毒的活性高低是决定能否对CGNs达到7080感染率的关键，而正确的腺病毒保存条件又是其活性高低的决定因素。我们曾经研究过储存条件对腺病毒感染CGNs的影响，并制定了腺病毒的最佳储存条件，即小量分装后置于20C/20%甘油或80C/50%甘油，一月内可保证感染率在70-80%。,申请者简历,申请者和项目组主要成员 学历 研究简历 文章目录 学术奖励 承担的任务,黎明涛 (Li Mingtao
16、) 项目负责人，中山大学中山医学院药理教研室教授，博士生导师，中山医学院蛋白质组学实验室主任。1996年获得博士学位，在美国科罗拉多大学从事2年博士后工作。学科专业为分子神经生物学与蛋白质组学，主要研究领域是神经元凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。近年来发表SCI文章36篇，其中作为第一作者或通讯作者在J Biol Chem, Mol Cell Biol, J Neurosci, Neuropharmacology和 Neuroscience等杂志上发表了12篇论文，并在Drug News Perspect上发表了相关专题综述。 近五年来，作为第一主持人获得了2项国家自然科学基金面上项目，已结题1项；1项国家自然科学基金广东省自然科学联合基金。在研项目进行顺利。 发表的相关论文 1. Ma C, Ying C, Yuan Z, Song B, Li D, Liu Y, Lai B, Li W, Chen R, Ching YP, Li M.
