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1、周俊宜 中山医科大学生化教研室,与细胞衰老和癌变,周俊宜 基础医学院生化教研室,端粒、端粒酶,概 论,碱基互补,按半保留复制的方式，子代保留了亲代 DNA 的全部遗传信息。,亲代 DNA,DNA,决定蛋白质的功能 将基因信息代代相传,复制,转录和翻译,生命活动的执行者 生命延续的物质基础,染色体DNA,端粒,端粒,七十年代：端粒分子组成确定,八十年代：端粒酶的发现,九十年代：端粒酶与细胞衰老和癌症,三十年代：端粒概念首次提出,研究概况,“端粒和端粒酶的研究历程就象不断伸缩的端粒本身变幻无穷，并且不时带给人们某些惊讶。从三十年代端粒概念首次提出，一直到今天活跃在恶性细胞中的端粒酶研究热潮的兴起，
2、人们眼中的端粒和端粒酶已不仅仅限于它们所形成的染色体的保护帽，它还显现出更加意味深长的内涵 ”,“人体的正常细胞经过有限的分裂次数后即进入衰老阶段，停止增殖而最终走向衰亡。呈恶性生长的癌细胞似乎摆脱了正常衰老过程的约束，在无拘无束地高速生长中获得“永生”。衰老和肿瘤相互对立却又同为人类的“天敌”，两者之间千丝万缕的关联一直以来为人们所关注。 近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤和衰老研究的一条全新纽带，国际权威期刊Cell、Science等逐年递增地刊载相关论文和报道，对端粒和端粒酶这一研究方向予以相当关注，认为有可能对肿瘤、衰老等重大生命课题产生深远影响。”,主要内容,端粒的结构与功能
3、端粒酶的结构与功能 端粒、端粒酶与细胞衰老 端粒、端粒酶与恶性肿瘤,端粒的结构与功能,二十世纪三十年代，两位著名的遗传学家Barbava McClintock和Hermann J.Muller发现，染色体的末端有一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分。如果缺少了这种成分，染色体之间就会互相粘连、出现结构的变化或其它错误的行为，以致影响到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。于是Muller从希腊文的“末端“（telos）和“部分“（meros）二词为这种特殊的成分创造了一个全新的术语“端粒“（telomere）。,1 端粒的发现,断端降解、断端融合、结构功能破坏,染色体DNA,X射线,
4、从希腊字的末端“telos”和部分“meros”创造了一个全新的单词：端粒 telomere,端粒帽 染色体 端粒帽,端粒的精确组成则是在七十年代末才首次被提出。1978年，美国科学家Blackburn和Joseph G. Gall发现，单细胞池塘生物四膜虫（Tetrahymena）的端粒是由一种极短的简单重复序列TTGGGG多次重复而成。 从那以后，包括动物、植物和微生物在内的多种生物的端粒序列已被确定，它们均是由富含G和T的简单重复序列不断重复而成。正是这些连接在染色体末端的核苷酸重复序列和结合在其上的一些蛋白质共同构成了真核生物染色体的“末端保护帽” 。,2 端粒的精确组成,1978年首
5、次发现四膜虫端粒的分子组成：,端粒 染色体DNA 端粒,人端粒的分子组成：,端粒末端回折结构,端粒 染色体DNA 端粒,1) GT链的5 3总是指向染色体的末端。 2) 重复次数不保守。 3) 链区内有缺口即游离的3-端羟基存在。 4) DNA的最末端不能进行末端标记，推测其分子是一个回折结构。,端粒结构的特征：,n（CCCTAA）,n（GGGATT）,3,5,（TTAGGG）n,（AATCCC）n,3,5,DNA聚合酶,-32P-dNTP,端粒DNA,缺口平移,5-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA-3 3-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGG
6、GTT-5,DNA聚合酶,5 3聚合酶 5 3外切酶,5,5,5-CCCCAACCC 3-GTTGGG,末端标记物,-32P-dNTP,5-CCCCAACCC 3-GGGGTTGGG,端粒帽 染色体DNA 端粒帽,n（CCCCAA） （TTGGGG）n,n（GGGGTT） （AACCCC）n,3,5,3 端粒结合蛋白,保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用 一般是紧密的非共价键结合,随着对端粒分子组成结构的阐明，端粒对维护染色体完整性的功能已不是一个笼统的概念。活跃在细胞中枢并当担着延续生命重任的染色体DNA其实面临的是一个“危机四伏”的境界，它对外要抵御核酸酶等各种因素袭击，对内则有一个难以“自
7、圆其身”的所谓“末端复制问题”。端粒的存在正是扮演了一个卫士的角色，它就象是一个尽忠职守的“生命卫士”，不但避免了外界因素的入侵，而且在复制过程中，把基因组序列包裹在内部，以牺牲自身而避免染色体结构基因被侵蚀，从而防止了遗传信息的丢失，维护了染色体结构和功能的完整性。,4 端粒的功能,对外: 抵御核酸酶等外界 对内: 染色体DNA的 因素的袭击 末端复制问题,保护染色体结构和功能的完整性,染色体,染色体DNA的末端复制问题：,3,5,5,3,RNA引物,3,3,RNA引物水解,即DNA复制过程不能“自始至终“完整地复制整个线性染色体，而是每次都在其5末端留下一个空缺未能填补（即RNA引物降解）
8、，如果细胞没有办法添补这些空隙，染色体DNA将随着每一次的细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。,3,5,5,3,RNA引物水解,端粒 染色体DNA 端粒,1)纤毛原虫动物 四膜虫：其巨核形成过程中，经历了端粒从无到有的发育过程。 2) 酵母 外源DNA转化酵母细胞后，在其末端形成新端粒的效率很高。,5 端粒的研究体系,1）早期的原始复制模型,2）端粒酶模型 3）重组模型,6 端粒的复制模型,端粒酶的结构与功能,酵母细胞,酵母细胞,酵母TS,四膜虫TS,Shampay的加尾实验,1 端粒酶的发现,Blackburn的实验,5,3,1）端粒的加尾方向是按GT链从5端
9、 3端。 2）每次加一个重复单位。 3）似为无模板复制。 4）被加尾的末端序列具有特异性。 5）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有酶活性的物质。,实验推论：,2 端粒酶的结构,1987年，Blackburn 柱层析 RNP结构,四膜虫端粒酶RNP,含有RNA组分和蛋白质组分，两者均为酶活性所必需。对RNA酶极为敏感。,CAACCCCAA,CAACCCCAA,端粒酶RNA,1）CAACCCCAA结构，有碱基修饰。,2）反义RNA封闭，能抑制酶活性。,反义RNA,3）Greider的点突变实验：,点突变,端粒酶RNA序列,C,A,端粒,端粒酶,A A C,T T G,C,G,C,A,T,C,端粒酶
10、蛋白质,1995年，Collins K等首次从四膜虫克隆到端粒酶蛋白质组分：,p80,p95,遗传密码,碱基互补,人类端粒酶蛋白质,？,核酸探针,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,2.聚合,1. 结合,3.移位,爬行模式,3 端粒酶的功能,TTGGGG,TTGGGG,末端补齐机制：,5,GGGGTT,（GGGGTT）n,端粒酶,5,G-G配对回折,3,5,DNA聚合酶,4 端粒酶活性的测定,1994年，Kim首创端粒重复扩增法（TRAP）。,TRAP的电泳检测,TS引物,CX引物,细胞提取物,端粒重复序
11、列,T4g32,Rnasin,TRAP buffer,dNTPs,extract,TS primer,Taq E,CX primer,2325 30 min,PCR仪,端粒、端粒酶与细胞衰老,染色体,端粒,端粒,端粒与细胞存亡密切相关,端粒长短与细胞生命历程密切相关,染色体,端粒,端粒,细胞将停止分裂而趋于老化,1）培养细胞： 端粒长度随分裂次数增多而缩短。 端粒长度和细胞分化程度呈反比。 2）人体： 端粒平均长度随年龄增大而变短。 体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。,相关实验证据,端粒酶与细胞存亡,端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞分裂导致的DNA缩短，使得染色体DNA完好无损
12、，细胞能够顺利地分裂繁殖。,相关实验证据：,1）四膜虫： 端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡。 2）酵母： 端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老。,正常人体细胞缺乏端粒酶活性。,与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比,人体细胞具有很长的端粒。,人的胚胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性。,人的端粒与端粒酶,端粒 染色体DNA 端粒,胚胎期,“人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在胚系细胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶活性就被抑制。即在胚胎发育时期获得的端粒，应已足够维系人体的整个生命过程中因细胞分裂所致的端粒缩短。 所以， 当人体出生以后，染色体端粒就象是一个伴随着细胞分裂繁殖的“生命之钟”，它历
13、数着细胞可分裂的次数同时也见证了细胞由旺盛地生长繁殖到走向衰老死亡的整个生命历程。”,正常细胞：,细胞分裂,细胞分裂,衰老死亡,细胞年轻化,抗衰老,端粒、端粒酶与恶性肿瘤,抗肿瘤靶点,1 端粒酶活性特异表达于恶性细胞,TRAP（-）,TRAP （-）,正常细胞,良性肿瘤,恶性肿瘤,1994年，Kim 创立“TRAP” 法检测端粒酶活性。,2 端粒酶特异性表达于恶性细胞的成因,解释性研究：,衰老死亡,诱导蛋白,端粒极度缩短，细胞死亡,细胞永生化,P53基因、Rb基因,介导细胞衰老,P53基因、Rb基因突变,细胞继续分裂至“危象期”,大量细胞死亡 少量细胞“永生化”,（端粒酶活化）,（端粒缩短）,3 端粒酶抑制剂-抗癌治疗的新靶点,1） 端粒酶靶点的优势 A 特异性：,B 广谱性：存在于各类恶性肿瘤细胞中 85%以上的恶性细胞中TRAP（+）,正常细胞,癌细胞,2） 抗癌策略,反义核酸,突变RNA的引入,端粒酶蛋白抑制剂,端粒酶生物学抑制剂,A 针对人端粒酶RNA组分,反义核酸,核酶,突变RNA的引入,B 针对端粒酶蛋白质,HTERT TP1,同源序列分析,P230-240,p127,1300Ku,
