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1、第四章 微生物的生化试验和血清学试验,第一节 细菌的生化试验,一、概述,(一)、什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。,(二) 检验细菌的生化试验范围,1、糖(醇)类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验 3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验,(三)生化试验的方法,在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。 在培养物中加入试剂,观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 根据酶作用的反应特性,测定酶的存在。 根据细菌对理化条件和药品的敏感性,观察细菌的生长情况。,(四
2、)生化试验的注意事项,1、待检菌应是新鲜培养物。培养1824h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间,多为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率,至少挑取23待检的疑似菌落分别进行试验。,二、糖醇类代谢试验,(一)糖醇类发酵试验 (二)葡萄糖氧化发酵(O/F)试验 (三)V-P试验 (四)甲基红(Methyl Red)试验 MR (五)七叶苷水解试验 (六)甘油品红试验,(一) 糖醇类发酵试验,1.原理:不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同,有的能分解多种糖醇),有的只能分解12种糖醇 ,有的分解糖醇能产酸产气,有的分解
3、糖醇只产酸不产气,根据这些特点,可鉴别细菌。,常用的糖醇,单糖:葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖:乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖:棉子糖 多糖:菊糖、肝糖、淀粉 醇类:甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇,2、试验方法:,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于糖发酵管中,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。置361.0 培养13天,每天观察结果。,3、结果观察和记录,记录: 产酸不产气,阳性,以“+”表示 产酸产气,阳性,以“”表示 不产酸产气,阴性,以“-”表示,气泡,导管,气泡,气泡,阳性,阳性,阴性,培养基变为黄色,培养基未变色、无气泡产生,(二)葡萄糖氧化发酵(O/F)试验,1、原
4、理: 细菌对葡萄糖的分解,分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖,无氧的条件下不能分解葡萄糖;发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖;不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。,2、方法,取待检菌,以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上,在其中一管加入一层(约1Cm)灭菌的液体石蜡以隔绝空气,在37培养24h天,每天观察结果。,3、结果观察与记录,(三) V-P试验,1、原理:某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中的氧氧化为双乙酰,在-萘酚和肌酸的催化作用下,双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称
5、VP(+)反应。,2、试验方法,(1)奥梅拉(OMeara)法 (2)贝立脱(Barritt)氏法 (3)快速法,()奥梅拉法:,将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基,于361 培养48h, 每1ml培养液加奥梅拉OMeara试剂0.1ml,摇动试管12min,静置于37恒温箱4h ,或在4850 水浴放置2h后判定结果。,(2)贝立脱法:,将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基,于361培养2天,每2ml培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml,摇动25min,阳性菌常立即呈现红色,若无红色出现,静置于室温或361 培养 4h ,如显现红色为阳性,呈
6、黄色或有类似铜色者,可判定为阴性。,(3)快速法:,将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中,挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环,乳化接种于其中,加入5%-萘酚3滴,40%氢氧化钠水溶液2滴,振动后放置5min,判定结果。不产酸的培养物不能使用。,3、结果观察与记录,(1)发酵管出现红色者,为阳性, 记V-P + (2)发酵管为黄色或铜绿色者,为阴性,记 V-P -,(四)甲基红试验(MR),1、原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后,由于代谢的途径不同,有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红色,为甲基红试验阳性 ;
7、有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物,培养液pH5.4,甲基红指示剂呈桔黄色,为甲基红试验阴性。,2、试验方法:,挑取新鲜的待试培养物少许,接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基,于361 或30 (以30 较好)培养35天,从第48h起,每日取培养液1ml,加入甲基红指示剂12滴,立即观察结果。,MR-VP试验原理及照片,V-P,3、结果观察与记录,(1)呈鲜红色或橘红色为阳性,呈淡红色为弱阳性,记MR +; (2)呈橘黄色或黄色为阴性, 记MR -,迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性,即可判定结果。,MR +,MR -,(五) 七叶苷水解试验,、原理:七叶苷被细菌分解后,生成葡萄糖和七叶素
8、,七叶素与Fe2+结合,生成黑色化合物,使培养基呈黑色,以此鉴别细菌。,2、试验方法:,将待试纯培养物少许,接种于七叶苷培养基,于361 培养24h,观察结果。,3、结果观察与记录,(1)培养基变为黑色或棕黑色者,为阳性,记录为 + (2)培养基不变色者,为阴性,记录为 -,(六) 甘油品红试验,1、原理: 某些细菌可分解甘油成为丙酮酸,并进一步脱羧生成乙醛,乙醛与无色品红生成醌式化合物,呈深紫红色,以此鉴别细菌。,2、试验方法:,取待检菌的新鲜纯培养物,接种于甘油品红肉汤培养基中,于361 培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照,观察结果。,3、结果观察与记录,(1)出现紫
9、色或紫红色者,为阳性,记录为+; (2)与对照管颜色相同者,为阴性,记录为-,复习题,1、什么是生化试验? 2、做生化试验要注意哪些事项? 3、简述糖醇类发酵试验的原理,写出其试验方法和结果的记录 5、简述甲基红试验(MR)的原理,写出其试验方法和结果的记录,(一)靛基质(吲哚)试验 (二)H2S试验 (三)尿素酶试验 (四)氨基酸脱羧酶试验 (五)苯丙氨酸脱氨酶试验 (六) 明胶(Gelatin)液化试验,三、氨基酸和蛋白质代谢试验,(一) 靛基质试验,1、原理:某些细菌含有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸,生成靛基质(吲哚)。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合,可形成红色化合物,即玫瑰吲哚,以此鉴
10、别细菌。,2、试验方法:,所用试剂: (1)柯凡克(Kovacs)试剂; 或 (2)欧波试剂,将待检菌小量接种于培养基中,于361 培养2448h时后,加入柯凡克试剂数滴,轻摇试管,呈红色者为阳性。 或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面,两液接触处呈现玫瑰红色者,为阳性反应,无红色者为阴性反应。,靛基质试验原理及照片,靛基质+,3、结果观察与记录,呈现玫瑰红色,为阳性反应,记+ 无红色者,为阴性反应,记-,(二) 硫化氢(H2S)试验,1、原理: 某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物,产生硫化氢,硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS,以此鉴别细菌。,2、试验方
11、法:,挑取待检菌,用穿刺接种法接种于三糖铁培养上,于361培养2448h,观察结果。,3、结果观察与记录,培养基底部呈黑色,为阳性,记+ 培养基底部无黑色,为阴性,记-,(三) 尿素酶试验,1、原理: 某些细菌能产生尿素酶,将尿素分解产生氨,氨使培养基变为碱性,使培养基中的酚红指示剂呈粉红色,培养基由黄色变为红色,为阳性。以此鉴别细菌。,2、试验方法:,挑取大量培养1824h的待试菌,浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上,不要到达底部,留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果,培养基变为粉红色为阳性,颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天,作最终判定。,尿素酶试验图,阳性,3、结果观察与
12、记录,培养基变呈粉红色,为阳性,记 + 培养基颜色不变,为阴性,记 -,(四) 氨基酸脱羧酶试验,1、原理: 某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色,为阳性, 如呈黄色为阴性,以此鉴别细菌。,2、试验方法,取待检菌,分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内,在361 培养14天,每天观察结果。,3、结果观察与记录,试验管呈紫色,对照管呈黄色,为阳性,记 + 试验管、对照管都呈黄色,为阴性,记 -。,试验管,对照管,阳性+,阴性-,对照管变黄,试验管变黄,阳性反应试验管颜色变化过程,紫色黄色紫色 原理:
13、对照管呈黄色,说明有细菌生长。在培养的早期(1012h),细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降,指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色,以后由于氨基酸脱羧生成胺,PH又回升至碱性,指示剂显紫色。,阳性反应试验管颜色变化过程: 紫色黄色紫色,(五) 苯丙氨酸脱氨酶试验,1、原理: 某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶,使苯丙氨酸脱去氨基,形成苯丙酮酸,苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物,以此鉴别细菌。,2、试验方法,从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物,接种于苯丙氨酸培养基上,在361 培养1824h后,加入氯化铁溶液45滴,转动试管,使试剂与菌苔表面充分接触,立即观察结果。,3、结果观察与记录,试验管立即出现绿色,为
14、阳性,记 + 无色为阴性,记 -。,加氯化铁试剂,出现绿色+,(六) 明胶液化试验,1、原理 有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步将多肽水解为氨基酸,明胶失去凝胶性质,使培养基由固态变为液态。,2、试验方法,挑取培养1824h的待试菌,以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于361。另取一支未接种的培养基一同培养作对照,每天取出两支试管,放入冰箱放置2030min后,再观察结果。,3、结果观察与记录,明胶液化,为阳性,+。 明胶凝固,为阴性,-。,复习题,1、简述靛基质试验的原理,写出其试验方法、结果的记录和注意事项
15、2、简述硫化氢试验的原理,写出其试验结果的记录和注意事项 3、简述尿素酶试验的原理,写出其试验方法、结果的记录 4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理,写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理,四、 有机酸盐和铵盐的利用试验,枸橼酸盐利用试验 丙二酸盐利用试验,(一) 枸橼酸盐利用试验,1、原理: 某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源,分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐;同时分解培养基的铵盐生成氨,使培养基变为碱性,使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色,为阳性。,2、试验方法,挑取待检菌,在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种,在361 培养14天,每天观察结果。,3、结果观察与记录,斜面有菌苔生长
16、,培养基斜面变为蓝色或深蓝色,为阳性,记+; 无菌苔生长,培养基斜面仍为绿色者,为阴性,记-,枸椽酸盐试验原理及斜面照片,阳性+,(二) 丙二酸盐利用试验,1.原理: 某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,以此鉴别细菌。,2、试验方法,取待检菌新鲜纯培养物,接种于丙二酸钠培养基上,于361 培养48h,观察结果。,3、结果观察与记录,培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+; 培养基无颜色变化,为阴性,记-,五、 呼吸酶类试验,氧化酶试验 过氧化氢酶试验 硝酸盐还原试验 氰化钾试验,(一) 氧化酶试验,1.原理: 氧化酶使细胞色素C氧化后,氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化,使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应,为阳性。,试剂,1% -萘酚-乙醇液 1%盐酸二甲基