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1、(10)申请公布号 CN 102732620 A(43)申请公布日 2012.10.17CN102732620A*CN102732620A*(21)申请号 201210189030.2(22)申请日 2012.06.11C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)(71)申请人江南大学地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号生物工程学院(72)发明人李崎 许维娜 王金晶 李永仙刘春凤 郑飞云(54) 发明名称一种快速鉴定啤酒酵母单倍体的方法(57) 摘要本发明公开一种快速鉴定啤酒酵母单倍体的方法，属于微生物鉴定领域。本发明采用菌落PCR和流式细胞技术联用的
2、实验策略，高效、精确、可重复性好。相较于传统的单倍体鉴定方法(长时间培养、染色镜检)而言，该发明能在极短的时间内得出实验结果，大大减少工作量和工作时间，实验结果也更加真实可信。而且，该发明能够同时鉴定出单倍体菌株的交配型(MATa/MAT)，并能将酿酒酵母单倍体标准菌对实验结果的影响降到最小。该发明中，MAT PCR不仅是菌株交配型的判定方法，更是倍性鉴定的初判手段，能快捷、方便的排除部分菌株的干扰。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书3页 附图2页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页1/1页21.一种快速鉴定啤酒酵母
3、单倍体的方法，其特征在于首先采用菌落PCR进行初步判定，然后通过流式细胞仪检测DNA含量确定倍性。2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述菌落PCR程序为：95变性5min；94变性1-2min，50退火30-60s，72延伸1-2min，25-40个循环；72总延伸5min。3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述流式细胞仪检测方法前处理步骤如下：菌株与单倍体标准菌W303-1A、W303-1B分别接种于YEPD液体培养基，28振荡培养12-24h；取0.5-1mL菌液到1.5mL离心管中，8,000g-12,000g离心5-10min收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液后离心、洗涤2-3次
4、，然后用PBS溶解；将菌液沸水浴2-8min杀死细胞；加入10-12L 10mg/mL的RNaseA，50水浴30-50min，然后加入20-24L 20mg/mL proteinase K，50水浴30-50min；离心后收集菌体，重悬于PBS后适当稀释，超声10-20s，间隔2-3s，重复2-3次；上机前每mL样品加入5-10L 1mg/mL的碘化丙锭(PI)，避光反应5-10min。权 利 要 求 书CN 102732620 A1/3页3一种快速鉴定啤酒酵母单倍体的方法技术领域0001 本发明涉及一种鉴定啤酒酵母单倍体的方法，特别是一种基于菌落PCR和流式细胞技术的方法，属于微生物鉴定领
5、域。背景技术0002 酵母是啤酒酿造的灵魂，对啤酒质量起至关重要的作用。工业啤酒酵母包括上面酵母(ale brewing yeast，Saccharomyces cerevisiae)和下面酵母(lager brewing yeast，Saccharomyces pastorianus)两大类，市售啤酒90以上是由下面酵母发酵而成，所以对工业啤酒酵母的研究也大多是针对下面酵母的。0003 下面酵母又称卡尔酵母，为异源杂合的多倍体或非整倍体，他们复杂的倍性给酵母改良和遗传研究带来了诸多困难。酵母单倍体菌株只有一套染色体，基因情况简单明了，常被用作遗传学和育种工作的模式菌株，既为性状遗传分析所必需
6、，又可为杂交作好亲本的准备。而且，单倍体菌株具有细胞小、蛋白酶A产量低、自溶性能好等优势，在理论研究和实际应用中都具有深远意义。但因为工业啤酒酵母长期生活在营养充足的环境里，产孢能力退化，单倍体分离率和成活率低，而且缺乏行之有效的鉴定方法，因此此方面的研究并不多。发明内容0004 本发明要解决的技术问题是建立一种能精确、高效鉴定啤酒酵母倍性的方法。0005 为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：首先采用菌落PCR进行初步判定，然后通过流式细胞仪检测DNA含量确定倍性；菌落PCR的特异性引物为：0006 MAT特异性引物(5-AGTCACATCAAGATC GTTTATGG-3)；0007 M
7、ATa特异性引物(5-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3)；0008 MAT特异性引物(5-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3)。0009 本发明的具体检测步骤如下：0010 (1)待检测的菌种稀释涂布YEPD平板，28培养2-3天后，用牙签小心挑取适量菌体到1.5mL离心管，为避免琼脂干扰PCR结果，可先将细胞洗涤2-3次，收集菌体后进行菌落PCR。0011 (2)PCR反应中所用三种引物分别为：MAT特异性引物(5-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3)；MATa特异性引物(5-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3)；MAT特异性
8、引物(5-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3)。PCR反应体系中(100L)加入适量细胞、三种引物各2L、dNTP 8L、10buffer 10L、rTaq酶0.5L、ddH2O 75.5L，适当混匀后置于TECHNE TC-5000PCR仪进行PCR反应，条件为95变性5min；94变性1-2min，50退火30-60s，72延伸1-2min，25-40个循环；72总延伸5min。0012 (3)PCR产物进行1.2-2的琼脂糖电泳。单倍体菌株的电泳结果只有一条条说 明 书CN 102732620 A2/3页4带，其中MATa型的为544bp，MAT型的为404bp，杂合二倍
9、体和多倍体菌株同时有两条条带，纯合二倍体和多倍体菌株只有相应的一条条带。0013 (4)选取电泳结果只有一条条带的菌种(单倍体或纯和多倍体、杂倍体)进行流式细胞分析。0014 (5)将选出的菌株与单倍体标准菌分别接种于YEPD液体培养基，28振荡培养12-24h。取0.5-1mL菌液到1.5mL离心管中，8,000g-12,000g离心5-10min收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液后离心、洗涤2-3次，然后用PBS溶解。0015 (6)将菌液沸水浴2-8min杀死细胞。加入10-12L 10mg/mL的RNaseA，50水浴30-50min，然后加入20-24L 20mg/mL protein
10、ase K，50水浴30-50min。离心后收集菌体，重悬于PBS后适当稀释，超声10-20s，间隔2-3s，重复2-3次。0016 (7)上机前每mL样品加入5-10L 1mg/mL的碘化丙锭(PI)，避光反应5-10min。0017 (8)样品倍性用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪进行分析。超纯水作为流动鞘液，用氩离子激发荧光，激发波长为488nm，使用660/16nm带滤光片作PI荧光分析，每个样品至少检测1104个细胞，得到FCM图谱。0018 (9)酵母菌株的倍性用DNA含量表示，通过与单倍体标准菌的对比得出：若待测菌与标准菌具有相同或相似的DNA含
11、量，则为单倍体菌株；若DNA含量为标准菌的倍数，则为相应倍性的纯和多倍体或杂倍体。0019 稳定性和可重复性分析：MAT PCR、琼脂糖电泳和流式细胞技术都是稳定性和可重复性良好的实验方法。经检验，当流式细胞仪荧光强度的线性相关系数(I)在0.98以上，前向角散射光检测灵敏度1m，前向角散射光和荧光信号的荧光通道全峰宽或半峰宽CV值5时，可以保证实验结果的准确性和可重复性。0020 本发明提供了一种客观有效的鉴定啤酒酵母单倍体的方法，其特征是基于MAT PCR和流式细胞技术联用的实验策略，高效、精确、可重复性好。相较于传统的单倍体鉴定方法(长时间培养、染色镜检)而言，该发明能在极短的时间内得出
12、实验结果，大大减少工作量和工作时间，实验结果也更加真实可信。而且，该发明能够同时鉴定出单倍体菌株的交配型(MATa/MAT)，并能将酿酒酵母单倍体标准菌对实验结果的影响降到最小。该发明中，MAT PCR不仅是菌株交配型的判定方法，更是倍性鉴定的初判手段，能快捷、方便的排除部分菌株的干扰。附图说明0021 图1为单倍体标准菌(W303-1A：MATa、W303-1B：MAT)、四株单倍体疑似菌(H2、H5、H12、H18)和一株啤酒酵母工业菌株G-03(倍性不明)MAT PCR产物的琼脂糖电泳图。M：marker；1：W303-1A；2：W303-1B；3：H2；4：H5；5：H12；6：H18
13、；7：G-03。0022 图2为单倍体标准菌W303-1B的FCM图谱。0023 图3为四株单倍体疑似菌的FCM图谱。具体实施方式0024 实例10025 以实验室保存的四株单倍体疑似菌(H2、H5、H18)、一株啤酒酵母工业菌株说 明 书CN 102732620 A3/3页5G-03(倍性不明)、单倍体标准菌W303-1A、W303-1B(购于中国高校工业微生物资源和信息中心，CICIM-CU)作为实验菌株验证本发明方法的可行性与准确性。0026 (1)将五株菌和单倍体标准菌稀释涂布YEPD平板，28培养2天后，用牙签挑取约1/2菌落的菌体到1.5mL离心管，用ddH2O洗涤3次，收集菌体后
14、进行菌落PCR。0027 (2)每个反应体系中(100L)加入三种引物各2L、dNTP 8L、10buffer 10L、rTaq酶0.5L、ddH2O 75.5L，适当混匀后置于TECHNE TC-5000PCR仪进行PCR反应，条件为：95变性5min；94变性1min，50退火30s，72延伸1min，30个循环；72总延伸5min。0028 (3)PCR产物进行2的琼脂糖电泳。如图1所示，四株单倍体疑似菌的电泳结果都只有一条条带，其中H2和H5的MAT PCR产物为404bp，H12和H18的为544bp。工业菌株MAT PCR产物有两条条带，不是单倍体菌株。为排除纯和多倍体或杂倍体的情
15、况，将H2、H5、H12和H18进行流式细胞分析。0029 (4)将四株菌和标准菌W303-1B分别接种于YEPD液体培养基，28振荡培养24h。取1mL菌液到1.5mL离心管中，10,000g离心10min收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液后离心、洗涤3次，然后用PBS溶解。0030 (5)将菌液沸水浴5min杀死细胞。加入10L 10mg/mL的RNaseA，50水浴45min，然后加入20L 20mg/mL proteinase K，50水浴45min。离心后收集菌体，重悬于PBS后，稀释至11071108个细胞/mL菌液，超声20s，间隔2s，重复2次。0031 (6)流式细胞分析上样前
16、，每mL样品加入5L 1mg/mL的碘化丙锭(PI)，避光反应5min。0032 (7)样品倍性用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪进行分析。每个样品检测4104个细胞，得到FCM图谱。每个样品做三个平行。酵母菌株的倍性用DNA含量(对应PI荧光强度)表示，通过与单倍体标准菌的对比得出。实验结果如图2、图3、表1所示，四株单倍体疑似菌与单倍体标准菌W303-1B具有相似的荧光强度峰值和平均荧光强度，即具有相似的DNA含量，所以H2、H5、H12和H18被确认为单倍体菌株。0033 表1五株菌FCM DNA和交配型分析结果0034 说 明 书CN 102732620 A1/2页6图1图2说
