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1、(10)申请公布号 CN 102228823 A(43)申请公布日 2011.11.02CN102228823A*CN102228823A*(21)申请号 201110105953.0(22)申请日 2011.04.26B01J 20/24(2006.01)B01J 20/30(2006.01)C12N 9/36(2006.01)(71)申请人中南民族大学地址 430074 湖北省武汉市洪山区民院路708号(72)发明人李步海 孙小梅 郭海霞(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所 42001代理人王敏锋(54) 发明名称一种改性啤酒废酵母吸附剂及其制备方法和应用(57) 摘要本发明涉及生物吸附
2、剂的制备及应用技术领域，具体公开了一种改性啤酒废酵母吸附剂及其制备方法和应用。本发明所公开的改性啤酒废酵母吸附剂是一种用柠檬酸修饰交联啤酒废酵母而制得的新型吸附剂，该吸附剂对溶菌酶有很好的吸附能力，可将其应用于提取溶菌酶。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页CN 102228824 A 1/1页21.一种改性啤酒废酵母吸附剂，其制备方法的步骤如下：（1）啤酒废酵母的预处理：称取啤酒废酵母置于锥形瓶中，加入8-12倍重量的水，20-30水浴振荡0.5-1.5h后取出静置20-40min，弃上层浑浊液，用水继
3、续将啤酒废酵母洗至上清液为无色，再用无水乙醇洗涤2-4次后，静置，然后抽滤使固液分离，所得固体置于60烘箱中干燥，备用；（2）交联啤酒废酵母的制备：称取经步骤（1）预处理过的啤酒废酵母加入到2wt%的戊二醛溶液中，戊二醛溶液的用量为30-35mL每g啤酒废酵母，于30-40摇床振荡反应10-12h后收集产物，产物先用水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤三次，以去除产物表面未反应的戊二醛，最后置于60烘箱干燥，得到黄色的交联啤酒废酵母，备用；（3）、修饰啤酒废酵母的制备：称取步骤（2）制备的交联啤酒废酵母，按照10-13mL每g交联啤酒废酵母的量加入N,N-二甲基甲酰胺，再加入与交联啤酒废酵母等质量的柠
4、檬酸和0.5倍交联啤酒废酵母质量的磷酸二氢钠，置于三颈烧瓶中130-140反应1.5-2.5h，并冷却回流、利用分水器分去反应过程中产生的水；反应结束后，抽滤进行固液分离，用水洗涤固体产物至滤液为无色，再用无水乙醇洗涤2-4次，最后置于60烘箱干燥，即得。2.权利要求1所述的改性啤酒废酵母吸附剂在吸附溶菌酶中的应用。权 利 要 求 书CN 102228823 ACN 102228824 A 1/7页3一种改性啤酒废酵母吸附剂及其制备方法和应用 技术领域0001 本发明涉及生物吸附剂的制备及应用技术领域，具体涉及一种改性啤酒废酵母吸附剂及其制备方法和应用。 背景技术0002 啤酒废酵母是发酵产业
5、的副产物，富含-OH、-NH2、-COOH等官能团。作为一种低成本的吸附剂，常被用来吸附废水中的有害物质。经常在其表面接枝各种官能团，增加活性位点数以增强它的吸附能力。许多研究已报道，利用啤酒废酵母表面的基团，进行衍生化反应，来螯合吸附金属离子。但把经过改性的啤酒废酵母用于吸附溶菌酶的研究，尚未见有报道。 0003 溶菌酶是一种很常用的酶，主要存在于鸡蛋清、人的眼泪、唾液及其他动物的体液中，它能够破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内溶物逸出而使细菌溶解。因为具有这一性质，溶菌酶通常作为防腐剂而得以应用(R.I
6、slam，J.Kite，A.S.Baker，A.Ching Jr.，M.R.Islam，African J.Biotechnology.Affinity purification of hen egg lysozyme using sephadex.5(2006)1902.1515-1520)。通常从鸡蛋清中提取溶菌酶，其中溶菌酶的含量为0.34(G.Zhang et al.Tris(hydroxymethyl)aminomethane-modified magnetic microspheres for rapid affinity purificationof lysozyme.Talan
7、ta 83(2011)1515-1520)。由于鸡蛋清中共存的杂蛋白较多，从中分离、纯化溶菌酶比较麻烦。目前，有关溶菌酶的分离、纯化主要有以下这些方法：膜分离(R.Ghosh，S.S.Silva，Z.F.Cui，Lysozyme separation by hollow-fibre ultrafiltration，19-24 Biochem.Eng.J.6(2000)19-24)、离子交换(E.Lichan，S.Nakai，J.Sim，D.B.Bragg，K.V.Lo，Lysozyme Separation from Egg White by Cation Exchange Column Ch
8、romatography，FoodSci.51(1986)1032-1036.C.Guerin-Dubiard，M.Pasco，A.Hietanen，A.Q.del Bosque，F.Nau，T.Croguennec，Hen egg white fractionation by ion-exchange chromatography.J.Chromatogr.A 1090(2005)58-67)、结晶析出(Y.C.Cheng，R.F.Lobo，S.I.Sandler，A.M.Lenhoff，Kinetics and equilibria of lysozyme precipitation an
9、d crystallization in concentrated ammonium sulfate solutions.Biotechnology and Bioengineering.Volume 94(2006)_177-188.C.J.Coen，J.M.Prausnitz，H.W.Blanch，Protein salting-out：Phase equilibria in two-protein systems Biotechnology and Bioengineering Volume 53，Issue6，pages 567-574，20 March 1997.)以及亲和沉淀法(T
10、.Goto，T.Ohkuri，S.Shioi，Y.Abe，T.Imoto，T.Ueda，Crystal structures of K33 mutant hen lysozymes with enhanced activities.Journal of Biochemistry Volume 144，Issue 5，November 2008，Pages 619-623.)。目前，用吸附的方法分离和纯化蛋白质的研究多有报道。主要通过静电、离子交换、氢键和亲和吸附来选择性吸附或特异性结合目标蛋白(T.Kawai，K.Saito，W.Lee，Protein binding to polymer b
11、rush，based on ion-exchange，说 明 书CN 102228823 ACN 102228824 A 2/7页4hydrophobic and affinity interactions，J.Chromatogr.B 790(2003)131-142.)。这方面的研究也有不少，例如：A.X.Lu等通过在胶原纤维上引入Fe(III)吸附溶菌酶(A.X.Lu et al.Preparation of Fe(III)-immobilized collagen fiber for lysozyme adsorption.Colloids and Surfaces A：Physico
12、chem.Eng.Aspects 301(2007)85-93.)，C.Garcia-Diego等选择染料配体来吸附溶菌酶(C.Garcia-Diego，J.Cuellar.Preparation and characterization of a dye-ligand adsorbent for lysozyme adsorption.Chemical Engineering Journal 143(2008)337-348.)，Z.Lei等利用碳微球吸附溶菌酶(Z.Lei et al.Adsorption of lysozyme on spherical mesoporous carbon
13、s(SMCs)replicated from colloidal silica arrays by chemical vapor deposition.Journal of Colloid and Interface Science 339(2009)439-445.)；D.Aktas Uygun和G.Zhang等通过磁性微球吸附溶菌酶等等(D.Aktas Uygun et al.Magnetic hydrophobic affinity nanobeads for lysozyme separation.Materials Science and Engineering C 29(2009)
14、2165-2173.G.Zhang et.al.Tris(hydroxymethyl)aminomethane-modified magnetic microspheres for rapid.affinity purification of lysozyme.Talanta 83，2011.)。然而，这些方法均比较复杂、成本较高。所以，有必要研究一种简单、快速的分离、纯化溶菌酶的方法。 发明内容0004 针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种改性啤酒废酵母吸附剂及其制备方法和应用。 0005 本发明所提供的改性啤酒废酵母吸附剂是一种用柠檬酸修饰交联啤酒废酵 母(交联剂为戊二醛)
15、而制得的新型吸附剂，该吸附剂对溶菌酶有很好的吸附能力，可将其应用于提取溶菌酶。 0006 为了实现上述技术目的，本发明采取了如下技术措施： 0007 一种改性啤酒废酵母吸附剂，其制备方法的步骤如下： 0008 (1)啤酒废酵母的预处理： 0009 称取啤酒废酵母置于锥形瓶中，加入8-12倍重量的水，20-30水浴振荡0.5-1.5h后取出静置20-40min，弃上层浑浊液，用水继续将啤酒废酵母洗至上清液为无色，再用无水乙醇洗涤2-4次后，静置，然后抽滤使固液分离，所得固体置于60烘箱中干燥，备用； 0010 (2)交联啤酒废酵母的制备： 0011 称取经步骤(1)预处理过的啤酒废酵母加入到2w
16、t的戊二醛溶液中，戊二醛溶液的用量为30-35mL每g啤酒废酵母，于30-40摇床振荡反应10-12h后收集产物，产物先用水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤三次，以去除产物表面未反应的戊二醛，最后置于60烘箱干燥，得到黄色的交联啤酒废酵母(也称未修饰酵母)，备用； 0012 (3)、修饰啤酒废酵母的制备： 0013 称取步骤(2)制备的交联啤酒废酵母，按照10-13mL每g交联啤酒废酵母的量加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入与交联啤酒废酵母等质量的柠檬酸和0.5倍交联啤酒废酵母质量的磷酸二氢钠(NaH2PO4作为催化剂)，置于三颈烧瓶中130-140反应1.5-2.5h，并冷却回流、利用分水器分去反应过程中产生的水；反应结束后，抽滤进行固液说 明 书CN 102228823 ACN 102228824 A 3/7页5分离，用水洗涤固体产物至滤液为无色，再用无水乙醇洗涤2-4次，最后置于60烘箱干燥，即得修饰啤酒废酵母(也称修饰酵母)，即本
