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1、(10)授权公告号 CN 101665772 B(45)授权公告日 2012.06.20CN101665772B*CN101665772B*(21)申请号 200910090905.1(22)申请日 2009.08.14CGMCC No，3217 2009.07.30C12N 1/18(2006.01)C12C 11/00(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(73)专利权人中国食品发酵工业研究院地址 100027 北京市朝阳区霄云路32号(72)发明人刘伟成 刘敬忠CN 1302864 A,2001.07.11,全文.(54) 发明名称啤酒酵母菌株及其应用(57) 摘要本发
2、明公开了一种啤酒酵母菌株及其在啤酒发酵方面的应用。本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No，3217。该菌株选育方法如下：原始出发菌种试管活化离子注入诱变激光诱变麦汁琼脂平板初筛发酵栓复筛传代稳定性试验中试试验。是一株优良的啤酒酵母菌株，具有适应于啤酒厂的大生产的潜力。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(56)对比文件审查员 于婷权利要求书1页 说明书5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利权利要求书 1 页 说明书 5 页1/1页21.酿酒酵母(S
3、accharomyces cerevisiae)ZGFJ-11，保藏编号CGMCC No 3217。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No 3217在啤酒发酵方面的应用。权 利 要 求 书CN 101665772 B1/5页3啤酒酵母菌株及其应用技术领域 ：0001 本发明属于微生物领域，特别涉及啤酒酵母菌株及其应用。背景技术 ：0002 啤酒酵母是啤酒发酵的灵魂，而优良菌种选育的工作是一个工作负荷较大而且见效较慢的过程。尽管在分子生物学技术非常发达的今天，采用基因工程等技术手段构建某一指标突出的啤酒酵母菌种已经不是一件困难的工作，但是基于消费者对安全性的考虑，以及完全删除某个基因或
4、者导入外源基因可能破坏酵母胞内的代谢平衡而影响啤酒发酵过程的指标平衡性特征的要求，所以到目前为止，国内外啤酒行业没有一家啤酒公司对外宣称其采用转基因酵母菌种生产啤酒，传统的(经典的)的诱变育种仍是大多数工业微生物育种最重要、最有效的技术0003 离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科，是利用离子注入设备产生高能离子束，并注入生物体引起遗传物质的永久改变，然后从变异菌株中选育优良菌株的方法。离子束对生物体有能量沉积和质量沉积双重作用，从而使生物体产生死亡、自由基间接损伤、染色体重复、移位、倒位或使DNA分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应，离子注入法育种对注入的离子种类、剂量的选择非常重要，H+、
5、N+、Ar+离子是常用的诱变剂，其中N+最常用，用作遗传育种的低能离子能量一般在3050keV，离子注入的剂量为10141017ion/cm2。可以获得高突变率，扩大突变谱，死亡率低，为筛选优良的突变型菌株提供了广阔的空间。0004 离子注入法的优点，其一正突变菌体的高效性，它能够引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，大幅提高变异的频率，证明了离子注入诱变育种的高效性，表明了离子注入具有质量沉积和能量沉积的双重效应，二者正是正突变率高效性的理论基础。其二菌体细胞表面刻蚀性，离子注入生物体的动量传递，可以根据直观的表面现象进行观察、研
6、究，注入的离子就像“手术刀”对细胞表面进行刻蚀，留下非常整齐的创面。动量传递的结果引起生物组织或细胞的表面溅射，造成细胞形态的变异。研究表明，离子注入微生物细胞的动量转移，导致细胞表面的刻蚀；且菌体刻蚀程度及修复能力随注入剂量的不同而有差别。其三菌体存活曲线呈“马鞍型”，存活率是微生物育种中常测指标，存活曲线是存活率的趋势直观表现。传统的物理、化学诱变方法(UV、-ray、EMS、DMS)均产生指数型或肩型的存活曲线，而离子注入诱变的存活曲线为先降后升再降的“马鞍型”。这说明了离子注入损伤小、突变率高的生物学效应。“马鞍型”存活曲线充分的说明了离子注入诱变具有独特的作用机制。0005 激光诱变
7、具有能量密度高、比较集中、单色性和方向性好、诱变当代即可出现遗传性突变等特点，当用激光照射生物体时，激光的光、电磁场、热和压力等效应直接作用于染色体，可导致染色体发生畸变，当激光使染色体一处断裂或多处断裂后，在结合前发生了变化或断裂的染色体断片改变位置，再以新的格局结合起来，就会出现染色体结构、形态和数量上的变异，这些变化可通过细胞有丝分裂或减数分裂传到下一代，产生遗传效应，从而引起DNA分子产生突变。但是上述这些方法同样难以克服传统诱变育种技术中存在的突变无说 明 书CN 101665772 B2/5页4法定向，效率低、不稳定等的缺点。0006 将这些新的方法组合起来进行复合诱变，复合诱变是
8、指采用2种或多种物理、化学和空间诱变手段进行诱变处理，普遍认为，复合诱变具有协同效应.如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用复合诱变较单一诱变效果好，使微生物菌株产生有利变异，从中选育出新品种的育种技术，单一因素诱变虽能引起某些性状的突变，但有时也存在着诱变效果不够理想或诱变谱比较单纯等不足，加之某一菌株长期使用诱变剂之后，除产生诱变剂“疲劳效应”外，还会引起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等，这对发酵工艺的控制不利，在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法进行菌株诱变。0007 选育发酵性能优良、且满足生物安全性的需求要求的菌种是有效提高啤酒发酵效率和质量的途径。发明内容 ：
9、0008 本发明所要解决的技术问题是提供一株新的啤酒酵母菌株及其在啤酒发酵方面的应用。0009 本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFJ-11，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No，3217，保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2009年7月30日.0010 该菌株特点如下：0011 在显微镜下观察，该菌株的细胞为腊肠形之纺锤形，一端芽殖，大小为(7.1-13.4)*(2.3-3.5)微米，在固体培养基上，该菌菌落为米黄色，表面褶皱，边缘刻蚀状。0012 出发菌株
10、为中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC1539的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，用于啤酒发酵的酵母。0013 本发明酵母菌株采用下述流程进行选育：0014 原始出发菌种试管活化离子注入诱变激光诱变麦汁琼脂平板初筛发酵栓复筛传代稳定性试验中试试验0015 本发明先采用离子注入法对出发菌株进行诱变，诱变后进行单菌落培养，接着对选育出来的菌株继续对其激光诱变，以巩固其诱变效果，通过麦汁琼脂平板培养基初筛，最后通过发酵栓实验选育优良的酵母菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性，并用气相色谱仪、离子色谱仪测定发酵液中的挥发性微量成份和有机酸的含量，最后进行实验效果的评
11、价。0016 ZGFJ-11菌株遗传稳定性结果见表1。0017 表1连续传代九次主要指标检测(单位：ppm)0018 说 明 书CN 101665772 B3/5页50019 从表1结果可以看出，经过连续传代九次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把ZGFJ-11菌株CGMCC No，3217作为选育得到的目的菌株。0020 3.4中试试验0021 将目的菌株ZGFJ-11CGMCC No，3217做中试实验，跟踪其各项具体性能指标，结果见表2、表3、表4。0022 酵母增值跟踪0023 表2中试发酵过程酵母性能指标0024 0025 从表2可以看出，与出发菌株相比，CGM
12、CC No，3217酵母增值和死亡率均为正常。0026 表3中试发酵过程酵母降糖和双乙酰还原指标0027 说 明 书CN 101665772 B4/5页60028 从表3可以看出，与出发菌株相比，CGMCC No，3217酵母降糖和还原双乙酰能力比出发菌株强。0029 表4中试发酵过程风味指标(单位ppm)0030 0031 经过100L中试试验结果表明：0032 1)从发酵力、降糖、双乙酰还原情况表明CGMCC No，3217菌种比出发菌种好；0033 2)乙醛指标：与出发菌株相比，CGMCC No，3217菌种的乙醛含量较低，降幅达到了29.35；0034 3)高级醇指标(主要以异戊醇为例
13、)：CGMCC No，3217菌种的高级醇指标低于出发菌种，降低幅度达到了12.90035 4)口感品评：出发菌种：口感较淡、且有涩味、高级醇味道CGMCC No，3217菌种：口感较为协调、淡爽。0036 有益效果：0037 1)本研究采用离子注入法与氦氖激光联用技术选育啤酒酵母菌株，离子注入法正突变率高，诱变效果好，选育得到了优良菌株ZGFJ-11，突变菌株其发酵和还原双乙酰性能比出发菌株好，同时该菌株稳定遗传好，在连续九次传代过程中，性状没有回复，各项性能指标都正常。0038 2)生产实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株代谢正常，降糖能力强，生产出来的清酒高级醇、乙酸和乙醛含量都较低，口感
14、品评方面与出发菌种相比，ZGFJ-11菌株酒体更协调，口感较好，清爽，是一株优良的啤酒酵母菌株，具有适应于啤酒厂的大生产的潜力。具体实施方式 ：0039 下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制说 明 书CN 101665772 B5/5页7本发明。0040 举例1：具体过程如下：首先在无菌条件下，取实验室保藏在试管斜面上的酿酒酵母菌一环，接入装有5ml麦汁的20ml试管中进行活化，25、24h，然后取活化好的菌悬液进行稀释，菌体浓度为108个/mL，将稀释的菌体悬液涂布于合适的无菌平皿上，尽量减少细胞重叠，置于离子注入机靶室中进行离子注入，输入能量选择40keV
15、两个水平，注入剂量为8.01014ion/cm2，出发菌株作为对照，离子注入完成后，将菌体用无菌水洗脱，用生理盐水配成浓度105个/ml左右的悬浮菌体液，各取100ul涂在13个麦汁琼脂平板上，进行单菌落筛选，接着将得到的单菌落做发酵栓实验。0041 将13个500ml三角瓶灭菌后编号，然后分别加入300ml麦汁，接入上面平板上的单菌落，然后装上发酵栓，在12恒温培养箱培养8d，由于酵母利用麦汁中的营养物质，结果产生的CO2以气体的形式放出，每天定时摇瓶、称重一次，利用巴林氏公式将CO2失重换算成已经发酵的浸出物重量，即酵母细胞降糖的克数。0042 激光诱变选育0043 将离子注入诱变后筛选好
16、的菌株，在无菌条件下，分别接于已编号8支装有5ml麦汁的20ml试管中，于28恒温恒湿培养箱中培养中20h。取上述活化的菌悬液分别通过离心机离心(时间5min，转速5000转)弃培养基，用生理盐水洗涤2次，同样的离心条件再分别收集菌体，然后用生理盐水配成浓度105个/ml左右的悬浮菌体，分别各取2ml于另外8支已编号的无菌试管中，用4个剂量(10min，20min，30min，40min)的He-Ne激光照射的酵母细胞，激光的输出功率为17mW，(玻璃会损耗掉5mW)，扩束直径3mm，照射方法为由试管底垂直向上照射，然后做发酵栓试验。选育得到本发明菌株CGMCC No，3217。0044 本发明菌株在中国食品发酵工业院30吨中试生产线进行生产，采用通用啤酒生产工艺条件，菌种培养
