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1、多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范 流式检测细胞凋亡几种方法的比较流式检测细胞凋亡几种方法的比较 2005 年年 10月 合肥月 合肥 多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范 凋亡简介凋亡简介 细胞膜事件细胞膜事件 线粒体事件线粒体事件 Caspase事件事件 细胞核事件细胞核事件 检测中面临的问题检测中面临的问题 多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范 凋亡简介凋亡简介 凋亡与坏死凋亡与坏死 凋亡的途径凋亡的途径 外源性途径 内源性途径 外源性途径 内源性途径 凋亡启动凋亡启动 细胞内细胞内Ca2+动员动员 Caspase激活 激活 脱水致细胞皱缩脱水致细胞皱缩
2、核染色质凝缩核染色质凝缩 线粒体膜电位丧失 线粒体膜电位丧失 细胞膜 细胞膜PS外翻外翻 核碎片形成 核碎片形成 DNA被切割成低分子量片段被切割成低分子量片段 细胞内酸化细胞内酸化 凋亡小体形成凋亡小体形成 凋亡启动凋亡启动凋亡早期凋亡早期凋亡中期凋亡中期凋亡晚期凋亡晚期 多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范 细胞膜事件细胞膜事件 细胞膜事件细胞膜事件Annexin V ? 正常细胞正常细胞(Normal Cell): 膜内膜内-磷脂酰丝氨酸磷脂酰丝氨酸(PS) 膜外膜外-磷脂酰胆碱、鞘磷脂磷脂酰胆碱、鞘磷脂 ? 凋亡细胞凋亡细胞(Apoptotic Cell): 膜内膜内-磷脂酰
3、丝氨酸磷脂酰丝氨酸(PS) 膜外膜外-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、PS 细胞膜事件细胞膜事件Annexin V 坏死细胞 早期凋亡细胞 活细胞 坏死细胞 早期凋亡细胞 活细胞 ? 检测方法：检测方法： 收集细胞并重悬于收集细胞并重悬于Binding Buffer(结合液结合液)中中 加荧光标记的加荧光标记的Annexin V和和PI 流式细胞仪检测结果流式细胞仪检测结果 室温、避光孵育室温、避光孵育5分钟分钟 独立的核 膜破损严重的细胞 晚期凋亡细胞 独立的核 膜破损严重的细胞 晚期凋亡细胞 细胞膜事件细胞膜事件Annexin V ? 检测特点：检测特点： 简便、快速、准确简便
4、、快速、准确区分区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。 ?细胞制备细胞制备(如贴壁细胞如贴壁细胞)或储存时细胞膜的破损会导致或储存时细胞膜的破损会导致PS跨膜分布的改变，造成假阳性；跨膜分布的改变，造成假阳性； ?巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时，巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时，Annexin V检测也会阳性。检测也会阳性。 ?注意事项：注意事项： 多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范 线粒体事件线粒体事件 线粒体膜电位(线粒体膜电位(m m)的崩溃)的崩溃 ? 发生在凋亡的早期发生在凋亡的早期 ? 可能与细胞色素可能与细胞色素c和和AIF的释放相关， 在存在
5、活化 的释放相关， 在存在活化Caspase的细胞中持续 一段时间后恢复正常 的细胞中持续 一段时间后恢复正常 线粒体膜电位(线粒体膜电位(m m)的崩溃)的崩溃 ? 染料染料JC-1(5,5 6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) 亲脂性阳离子荧光染料 正常细胞 亲脂性阳离子荧光染料 正常细胞线粒体内多聚体线粒体内多聚体-红色荧光红色荧光(Ex:488nm, Em:580/590nm) 凋亡细胞凋亡细胞细胞质内单体细胞质内单体-绿色绿色荧光荧光(Ex:488nm, Em:510/527nm)
6、喜树碱喜树碱(CPT)诱导诱导HL-60细胞凋亡，细胞凋亡， 3小时 后用 小时 后用JC-1检测线粒体膜电位的改变。可见， 凋亡细胞红色荧光降低。 检测线粒体膜电位的改变。可见， 凋亡细胞红色荧光降低。 线粒体膜电位(线粒体膜电位(m m)的崩溃)的崩溃 ? 检测方法：检测方法： 收集细胞于收集细胞于MitoCapture溶液溶液(含含JC-1)中中 离心、去上清离心、去上清 重悬于孵育缓冲液中重悬于孵育缓冲液中 37oC孵育孵育15-20分钟分钟 流式分析流式分析 FL1:凋亡细胞；凋亡细胞；FL2:正常细胞正常细胞 ? 检测特点：检测特点： ?简便；简便； ?快速快速 产品名称产品名称
7、产品编号产品编号规 格规 格生产商生产商 K250-2525 testsBiovision K250-100100 testsBiovision MitoCaptureTM Apoptosis Detection Kit ?注意事项：注意事项： ?最近研究发现，线粒体膜电位的崩 溃在有些细胞中并不是细胞色素 最近研究发现，线粒体膜电位的崩 溃在有些细胞中并不是细胞色素c和和 AIF释放的必需条件。释放的必需条件。 多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范 Caspase事件事件 1. 荧光标记的荧光标记的Caspase抑制性底物抑制性底物 ? 荧光标记的荧光标记的Caspase抑制性底物
8、抑制性底物 膜通透性高；不可逆结合膜通透性高；不可逆结合 荧光标记的荧光标记的Caspase抑制性底物被凋亡细胞 摄取并结合，而正常细胞不能结合该底物。 因此洗涤后，凋亡细胞可检测到荧光，正常 细胞则不能。 抑制性底物被凋亡细胞 摄取并结合，而正常细胞不能结合该底物。 因此洗涤后，凋亡细胞可检测到荧光，正常 细胞则不能。 ? 检测原理：检测原理： FITC(Rhodamine)-VAD-FMK(通用通用) FITC(Rhodamine)-VDVAD-FMK(Caspase-2) FITC(Rhodamine)-DEVD-FMK(Caspase-3) FITC(Rhodamine)-IETD-F
9、MK(Caspase-8) FITC(Rhodamine)-LEHD-FMK(Caspase-9) 活化活化Caspase的检测的检测 细胞凋亡时活化细胞凋亡时活化Caspase-3的检测。的检测。 Jurkat 细胞无诱导细胞无诱导(A)或用喜树碱诱导或用喜树碱诱导6h后，使用后，使用CaspGLOWTMFITC Caspase- 3 Staining Kit(产品编号：产品编号：K183-100)检测活化的检测活化的Caspase-3。 1. 荧光标记的荧光标记的Caspase抑制性底物抑制性底物 活化活化Caspase的检测的检测 ? 检测方法：检测方法： 诱导细胞凋亡诱导细胞凋亡 加
10、入荧光标记的抑制性底物加入荧光标记的抑制性底物 (如如FITC-VAD-FMK等等) 离心、洗涤离心、洗涤2次次 37oC孵育孵育0.5-1小时小时 重悬细胞、流式分析重悬细胞、流式分析 FITC:FL1；Rhodamine:FL2 ? 检测特点：检测特点： ?简单；简单； ?灵敏灵敏 ?快速快速(0.5-1小时小时) ?注意事项：注意事项： 荧光标记的荧光标记的Caspase抑制性底物的特异性不够高，在凋亡细胞中可能也会与抑制性底物的特异性不够高，在凋亡细胞中可能也会与Caspase 以外的蛋白结合。适用于区分凋亡和坏死的细胞。以外的蛋白结合。适用于区分凋亡和坏死的细胞。 1. 荧光标记的
11、荧光标记的Caspase抑制性底物抑制性底物 活化活化Caspase的检测的检测 产品名称产品名称规格规格生产商生产商 CaspGLOWTMGreen(Red) Multi-Caspase Staning Kit25 tests/100testsBiovision CaspGLOWTMGreen(Red) Caspase-2 Staning Kit25 tests/100testsBiovision CaspGLOWTMGreen(Red) Caspase-3 Staning Kit25 tests/100testsBiovision CaspGLOWTMGreen(Red) Caspase-
12、8 Staning Kit25 tests/100testsBiovision CaspGLOWTMGreen(Red) Caspase-9 Staning Kit25 tests/100testsBiovision ? D2R (aspartyl)2-rhodamine 110，二门冬氨酰，二门冬氨酰-罗丹明罗丹明110 Caspase通用底物通用底物 ?膜通透性高膜通透性高 ?D2R为非荧光物质为非荧光物质 ?D2R被活化的被活化的Caspase剪切后，释放出剪切后，释放出Rhodamine110，发出绿色荧光，发出绿色荧光 2. Caspase底物底物 活化活化Caspase的检测的检
13、测 CaspSCREEN 凋亡检测试剂盒对凋亡的分析。凋亡检测试剂盒对凋亡的分析。 喜树碱(Campothecin)(2uM)诱导Jurkat 细胞4小时，收集细胞并用 CaspSCREEN Caspase Screening Kit(产品编号：产品编号：K200-100)染 色，流式分析。 2. Caspase底物底物 活化活化Caspase的检测的检测 ? 检测方法：检测方法： 收集细胞并重悬于收集细胞并重悬于D2R Incubation Buffer(孵育液孵育液)中中 加加DTT和和D2R 流式细胞仪分析流式细胞仪分析(FL1通道通道) Ex/Em=488/530nm 37oC 孵育
14、孵育10-20分钟分钟 ?简单简单 ?高度敏感高度敏感 ?快速快速(20分钟分钟) ?特异性高特异性高 ? 检测特点：检测特点： 产品名称产品名称产品编号产品编号规 格规 格生产商生产商 K200-2525 testsBiovision K200-100100 testsBiovision CaspSCREENTMCaspase Screening Kit 多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范 细胞核事件细胞核事件 亚二倍体峰(凋亡峰)亚二倍体峰(凋亡峰) 凋亡细胞比例凋亡细胞比例; 细胞周期分布细胞周期分布; 凋亡发生的时相凋亡发生的时相 ? 染料：染料：PI(碘化丙啶碘化丙啶) 亚二倍体峰(凋亡峰)亚二倍体峰(凋亡峰) ?注意事项：注意事项： ?固定：乙醇固定：乙醇，不能用多聚甲醛。，不能用多聚甲醛。联科公司即将引进联科公司即将引进小片段小片段DNA高效抽提试剂高效抽提试剂盒。盒。 对照对照 (未诱导凋亡未诱导凋亡) 凋亡凋亡 (常规方法抽提常规方法抽提) 凋亡凋亡 (高效抽提高效抽提) 亚二倍体峰(凋亡峰)亚二倍体峰(凋亡峰) ?注意事项：注意事项： ?试剂的选择试剂的选择-不能用抽提细胞核的试剂：不能用抽提细胞核的试剂： BD公司的公司的Cycletest Plus DNA Reagent Kit (用去污剂用
