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1、测序前文库制备-Illumina 测序平台 报告人： 刘竹琳 Email: supportneb- Tel：010 82378266-2 2005 Roche 454 2006 Illumina Solexa 2007 ABI Solid 2010 Illumina HiSeq 2000 2014 Illumina HiSeq X Ten 二代测序平台 测序应用 基因组学 全基因组 De novo 测序 全基因组重测序 外显子 & 目标区域捕获测序 转录组学 转录组测序 数字基因表达谱测序 Small RNA 测序 长链非编码 RNA 测序（LncRNA-Seq） Circ RNA 测序 表观
2、组学 甲基化测序 ChIP 测序 测序流程 NEBNext Reagents for Illumina Illumina DNA Genomic DNA 原理 应用 ChIP DNA RNA Directional 原理 应用 Non- Directional Small RNA 原理 应用 DNA Library Prep for Illumina FragmentationEnd RepairdA TailingAdaptor LigationPCR Enrichment 片段化 基因组 DNA 末端补平磷酸化 （T4、Klenow、 PNK、dNTP） 加 A 尾 （Klenow exo
3、-、dNTP） 连接接头 （T4 DNA Ligase） PCR （Q5、dNTP） DNA Library Prep for Illumina -Fragmentation FragmentationEnd RepairdA TailingAdaptor LigationPCR Enrichment 片段化 基因组 DNA 末端补平磷酸化 （T4、Klenow、 PNK、dNTP） 加 A 尾 （Klenow exo-、dNTP） 连接接头 （T4 DNA Ligase） PCR （Q5、dNTP） What is DNAWhat is DNA fragmentationfragmentat
4、ion？ DNA fragmentationis the separation or breaking of DNA strands into pieces. Methods of DNA Fragmentation Methods of DNA Fragmentation Nebulization: Illumina(100-200bp)/ Roche454(500-800bp) Sonication : ABI SOLiD(100bp) Enzyme-based: NEB NEBNextTMdsDNA Fragmentase 简介 由两种酶组成，一种切刻双链中的一条链，另一种在切刻的对侧切
5、 割 能将 dsDNA 切割成 100-800 bp，片段大小取决于反应时间 片段化的 DNA 末端是粘性末端，5磷酸基，3羟基 DNA 的量与酶的比例是常数，反应时间长短决定片段大小 DNA 片段化的方法 酶学法 Vvn endonuclease mutant T7 endonuclease mutant 组成：两种内切酶 创伤弧菌核酸酶突变蛋白质 （Vibrio vulnificusnuclease mutant protein） T7 核酸内切酶突变蛋白质 （T7 endonuclease mutant protein） NEBNextTMdsDNA Fragmentase NEBNex
6、tTMdsDNA Fragmentase 切割原理 dRibo 5 3 dRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibo dRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibodRibo 53 dsDNA Fragmentase generates dsDNA breaks in a time-dependent manner The resulting DNA fragments contain short overhangs, 5 -phosphates, and 3 - hydroxyl groups. Vvn endonuclease mutant
7、 T7 endonuclease mutant Fragmentase Reaction Protocol 1. 建立反应体系， 不要加入 Fragmentase 2. 放置冰上5分钟 3. 加入 Fragmentase 4. 37温育，温育 时间根据情况而定 5. 终止反应：加入 5 ul 0.5 M EDTA 6. 用于 DNA 末端修 复、分离不同大小片 段、分析 基因组 DNA WGA DNA PCR 产物 （1-6 kb） RT-PCR 产物（1-6 kb） GC-rich 基因组 DNA AT-rich 基因组 DNA M0348S50 次反应100 ul￥1149.00 M034
8、8L250次反应500 ul￥4569.00 加入顺序：H2O、DNA、buffer、BSA Fragmentase 优势 Figure 3: Relative size distribution of E. coli DNA fragments with NEBNext dsDNA Fragmentase vs. Nebulization as seen using the Bioanalyzer 2100. The dsDNA Fragmentase sample was incubated for 30 minutes at 37C with 0.5 g of DNA per l of
9、NEBNext dsDNA Fragmentase in 1X Fragmentase Reaction Buffer with 100 g/ml BSA. The Nebulizer sample was prepared by nebulization of DNA in 50% glycerol for 6 minutes at 35 psi. 优势 易缩小或放大体系，高通量 易控制片段大小 价格便宜 使用方便 DNA末端均一 DNA Library Prep for Illumina End Repair What is end repairWhat is end repair？ En
10、d repair is used for blunting and phosphorylation of DNA ends. T4 DNA Polymerase 3 5 exonuclease activity 5 3 polymerase activity T4 PNK Addition of 5 -phosphates 3 3 5 5 5 53 3 3 3 3 3 5 5 5 5 Remove 3overhangs 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 35 5 3 3 Fill-in 5overhangs FragmentationEnd RepairdA TailingPCR E
11、nrichmentAdaptor Ligation 片段化 基因组 DNA 末端补平磷酸化 （T4、Klenow、 PNK、dNTP） 加 A 尾 （Klenow exo-、dNTP） 连接接头 （T4 DNA Ligase） PCR （Q5、dNTP） DNA Library Prep for Illumina dA Tailing FragmentationEnd RepairdA TailingAdaptor LigationPCR Enrichment 片段化 基因组 DNA 末端补平磷酸化 （T4、Klenow、 PNK、dNTP） 加 A 尾 （Klenow exo-、dNTP）
12、连接接头 （T4 DNA Ligase） PCR （Q5、dNTP） What is dA Tailing?What is dA Tailing? Adds a single A to the 3end of the fragmented, blunt, phosphorylated DNA Klenow Fragment (3 5 exo) A A DNA Library Prep for Illumina Adaptor Ligation FragmentationEnd RepairdA TailingAdaptor LigationPCR Enrichment 片段化 基因组 DNA
13、末端补平磷酸化 （T4、Klenow、 PNK、dNTP） 加 A 尾 （Klenow exo-、dNTP） 连接接头 （T4 DNA Ligase） PCR （Q5、dNTP） What is What is adaptradaptr ligation?ligation? Ligation of adaptors onto the A-tailed Sample DNA T4 DNA Ligase T A A T DNA Library Prep for Illumina PCR Enrichment FragmentationEnd RepairdA TailingAdaptor Liga
14、tionPCR Enrichment 片段化 基因组 DNA 末端补平磷酸化 （T4、Klenow、 PNK、dNTP） 加 A 尾 （Klenow exo-、dNTP） 连接接头 （T4 DNA Ligase） PCR （Q5、dNTP） What is PCR Enrichment ?What is PCR Enrichment ? Amplification of Adaptor-ligated sample DNA 5 ng: 13-15 Cycle 50 ng: 10 Cycle 1 ug: 0-6 Cycle NEBNext Reagents for Illumina Illumi
15、na DNA Genomic DNA 原理 应用 ChIP DNA RNA Directional 原理 应用 Non- Directional Small RNA 原理 应用 Original NEBNext Ultra for Illumina Optimized for 5 ng 1 g input of genomic DNA (the first NEBNext kits required 1 5 g). Clean-up steps were minimized. Each step was optimized: Combined steps: End Repair and dAT
16、ailing Novel ligation reagents: New Ligase Master Mix (Blunt/TA), optimized NEBNext Adaptor Novel polymerase reagents: NEBNext Q5 High-Fidelity PCR Master Mix Fast (2.5 - 3 hrs) and minimal (15 min) hands on time The original Ultra DNA kit was released in Oct. 2012, and it was the first streamlined kit on the market for Illumina library preparation. Original
