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1、实验一 DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组 southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核
2、蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1 CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexa
3、decyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。2 SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（5565）条件下裂解
4、细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）
5、尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA 处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。3材料和试剂：3
6、.1长春花叶片3.2 试剂（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的-巯基乙醇。表1 CTAB提取缓冲液配制用HCl 调pH 值。（2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。（3）氯仿/异戊醇：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4保存。4 仪器设备离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。5 方
7、法与步骤：5.1 在提取过程中用到的吸头，提取缓冲液等先高压灭菌（121，20min），取出后待用； 5.2 取大约指甲盖大小的植物叶片，放入1.5ml的EP管中, 加入液氮，用钢珠研磨成粉末状，再加入600L的 CTAB提取缓冲液，；5.3 65水浴锅中水浴40min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，颠倒几次，乳化1min。4，11,000rpm离心10min；5.4 吸上清到新离心管中（约400l），加入等体积预冷异丙醇，混匀，-20放置20min沉淀DNA； 5.5 5000 rpm常温离心15min，倒掉上清液； 5.6 用75%乙醇（900l）洗沉淀，11,000rp
8、m离心2min，倒掉乙醇，再用乙醇同样处理一次；5.7 置于干燥仪干燥10min，将水分蒸干；5.8 加入50L去离子水，融解 DNA，同时加入RNA酶(按每50L DNA加入1L RNase)，3730min；5.9 利用分光光度计检测OD260,同时进行1凝胶电泳检测；5.10 琼脂糖电泳检测DNA：制作1%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液5L电泳检测；5.11 -20保存DNA备用；5.12 提取的DNA的浓度检测：取少量待测DNA样品，用蒸馏水稀释1,000倍；用蒸馏水做空白，分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值。【注意事项】1. 叶片磨得越细越好。2. 注意移液器的正确
9、使用。3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。6. 思考题1制备的DNA 在什么溶液中较稳定?2为了保证植物DNA 的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？7 实验结果：结果计算式中OD260nm 为260nm 处的光密度；L 为比色杯光径（cm）；0.020 为1g/mL DNA 钠盐的光密度。DNA 的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA 溶液适当稀释后，在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD23
10、0nm 和OD280nm。如OD260nm/ OD230nm2OD260nm/ OD280nm1.8，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过0.3。8 实验分析：传统DNA提取方法CTAB法、SDS法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA酶除去核酸中的RNA;然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70%乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE溶解DNA备用。CTAB是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐(0.7mol/L)浓度下可溶,并
11、稳定存在,但在低盐浓度(0.10.5mol/LNaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB-核酸复合物再用70%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(5565)条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使SDS-蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯
12、仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA,但所得到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA溶液中有机物质对DNA聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康。DNA提取新方法 近年来出现了以螯合树脂、特异性DNA吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础DNA提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土
13、壤环境样品DNA。已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组DNA的报道。马小军等将CTAB液提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过Wizard纯化系统纯化得到的DNA,RAPD扩增效果良好,产率达2250g/g。张博等用硅珠(SiO2)颗粒吸附DNA纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的DNA样品。黄椰林等对常规CTAB法提取的DNA用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN的APCR产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料。袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA。目前国内外开发了多种商品化的DNA提取纯化试剂盒,其分离
14、原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效,DNA质量较高,但价格昂贵,提取量少。著名的国外的试剂盒生产厂家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、TaKaRa、Whatman等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。国内的生物公司发展迅速,如上海生工、北京天为、北京博奥等也开发了系列试剂盒,质量与国外厂家相当,价格较低。除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物
15、公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。DNA试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA提取扩增PCR试剂盒,将DNA提取和PCR扩增结合起来,极大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich公司的SigmasExtract2N2AmpPlantPCRkit等。另外,还有高通量的DNA提取产品,如高通量组织细胞研磨仪MM301,在常温和冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可以多达48个甚至192个。美国应用生物系统公司6100型核酸提取仪,可用于RNA、DNA的提取纯化,可自编程序,可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不同来源的样品中同时提取96个样品。
