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1、新药药理学支气管哮喘病特效药研究方案及临床前筛选和实验方法概述四川大学华西药学院 2012级 8班 周鹏翔 2012141661009一、研究背景概述1选题及意义支气管哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与气道慢性炎症性疾患。这种慢性炎症导致气道高反应性的产生，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和（或）凌晨发作、多数患者可自行缓解或经治疗缓解1 引自百度百科“支气管哮喘”词条1。而有关支气管哮喘，众多细胞因子参与其发作，其中白介素23（IL23）水平和哮喘发作密切相关。IL-23是
2、2000年发现的细胞因子，具有多种生物学功能，并在多种疾病中发挥重要作用。近年来，IL-23 在支气管哮喘中的作用得到了关注。因此，以IL-23为作用靶点的药物可能对支气管哮喘产生积极的疗效。2.作用因子及靶点IL-23由p19和IL-12中的p40 两个亚基组成，它们之间以二硫键相联结。人和鼠的p19 相应蛋白质中均含有5个半胱氨酸残基，无N-糖基化位点，两者有70同源，其蛋白质组成大部分与IL-12p35、IL-6和G-CSF相近，因而在小鼠体内的药理学实验结果对人有一定的借鉴意义。IL-23的受体由IL-12R中的一个亚基IL-12R1和IL-23R两个亚基组成。人IL-23R的基因定位
3、于人1号染色体距离IL-12R2大约150 kb的地方。人T细胞、自然杀伤细胞（NK）包括NK白血病细胞均可以表达IL-23R2 李艳春，鲁继荣.白介素-23的生物学功能.临床儿科杂志。2010.3：295-299。因此，本“新药X”（下称X药）选择以肺组织细胞中IL-23R为作用靶点，特异性竞争性地抑制IL-23和其受体结合，减少其表达蛋白产物的生成，从而缓解支气管哮喘。3靶点选择的文献依据通过构建动物模型，分为正常组、哮喘组，应用ELISA 法检测两组小鼠外周血IL-23 水平、RT-PCR 法检测肺组织中IL-23p19mRNA 表达、免疫组化法检测肺组织中IL-23 表达;分离小鼠脾脏
4、T淋巴细胞进行体外培养，应用RT-PCR 法检测小鼠脾脏T淋巴细胞IL-23p19mRNA表达水平、Western blot检测IL-23p19蛋白表达情况3 李艳春，孙萌，赵丽娜，鲁继荣.白细胞介素23在哮喘小鼠动物模型中表达的研究.中国免疫学杂志.2012.4:357-361（图片以及表格数据均引用于该文章）。结果表明哮喘小鼠中，IL-23 在血清、肺组织、脾脏T淋巴细胞中表达均较正常小鼠明显增高（P0.01）。另一篇文献也做了类似的研究，将45只雌性C57/6J小鼠随机分为哮喘组、肥胖哮喘组（肥哮组）和对照组各15只。卵白蛋白激发致敏和高脂饮食制作肥胖哮喘模型，计数支气管肺泡灌洗液（BA
5、LF）中细胞总数并分类，酶联免疫吸附法法测定肺组织匀浆中白细胞介素（IL）-17、IL-23和8-异前列腺素2（8-iso-PGF2）水平。结果表明：肥哮组肺组织匀浆的IL-17、IL-23和8-iso-PGF2水平分别为(65.835.69)pg/ml、(141.5214.62)pg/ml和（61.337.75）pg/ml均高于哮喘组和对照组（P0.05）4 王伟，高倩，唐平华.IL-17和IL-23在肥胖哮喘小鼠气道炎症中的作用及其与氧化应激的关系.当代医学.2012.5第18卷第13期。二、针对特定靶点离体筛选的方法X药拟特异性阻断肺组织细胞的IL-23R，从而发挥治疗支气管哮喘的作用。
6、由于细胞因子必需通过与其相应的受体结合后才能具有生物活性，因此以炎症细胞因子受体为靶位建立受体拮抗剂的筛选模型，对不同来源化合物(组合化学库、天然产物等)进行筛选，有可能获得相应受体的拮抗剂，这些拮抗剂通过和受体天然配基(炎症细胞因子)竞争结合受体，从而可以达到降低细胞因子活性治疗炎症等疾病的目的5 李元.以炎症相关细胞因子受体为靶位的受体拮抗剂筛选模型构建及受体拮抗剂研究.Bull Med Res. Jul2005, Vol.34 No.7。离体建立基本的药物筛选的总体思路是，从天然产物中选择适当的筛选模型，筛选得到一系列化合物，进一步优化后得到先导化合物，随后进行高通量筛选（High-th
7、roughput screening, HTS），最终得到目标几种有效的化合物，进而利用现代仪器分析的各种手段鉴定这几种化合物的结构，依据药物化学等方法的构效关系对该化合物进行结构修饰以从理论上完善其分子结构，从而指导该类化合物的全合成或半合成的进行，并且以有利于其在体内的药效学和药动学性质，若有明显毒性或副作用的结构则淘汰，这为进一步的临床前研究做好理论准备。X药采用受体配体结合技术的离体筛选模型，即从细胞、分子水平进行药物筛选，其基本机制是X药阻断IL-23与其IL-23R的特异性结合，从而筛选出高效专一的肺组织细胞IL-23R拮抗剂。具体方法可以概述为：通过文献调研，从大量土壤（四川、云
8、南、贵州等地）真菌代谢产物中提取出具有舒张支气管平滑肌、止咳、抗肺部炎症等临床疗效的成分，将小鼠的离体肺组织细胞膜受体作为筛选模型，利用高灵敏度的放射性同位素标记X药，利用X药与IL-23R高度特异性结合形成受体-配体复合物，并通过测量该复合物的放射性，从而筛选出目标先导化合物群。进一步利用HTS技术（是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分子水平的筛选模型，根据样品与靶点结合的表现，判断化合物的生物活性的一种技术） ，更为精确地筛选出有效化合物，然后通过各种光谱手段和合成手段确定各种化合物的结构，结构修饰并进一步筛选，最后得到几种可能的有效化合物，进行进一步的临床前研究。三、新药临床前药理学研究
9、实验方案1.主要药效学研究方案1.1 药效学实验方案1.1.1 实验动物模型I： 23周龄昆明小鼠30只，均为雌性，清洁级，体重1015g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。模型II：23周龄昆明小鼠30只，均为雌性，清洁级，体重1015g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。(注明：模型I和II均为诱发性动物模型，如有条件也可选用模型III：自发性哮喘小鼠模型。)模型III: 23周龄患有自发哮喘的昆明小鼠20只，均为雌性，清洁级，体重1015g，来源于四川大学实验动物中心动物房，恒温（25度），清洁级环境，自由取水。
10、)1.1.2 主要试剂和仪器模型I： 卵白蛋白(ovalbumin，OVA，GradeV，美国Sigma 公司)；胆固醇（广州金锐化工）；一定浓度的X药液；生理盐水；小鼠白细胞介素IL-23 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（ADL 公司）；雾化器（德国PARI公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司）6 实验试剂和仪器和部分方法参考文献：王伟，高倩，唐平华.IL-17和IL-23在肥胖哮喘小鼠气道炎症中的作用及其与氧化应激的关系.当代医学.2012.5第18卷第13期；RT-PCR检测仪器；组织抗修复液；SP试剂盒、DAB显色试剂盒。模型II： 橄榄
11、花粉提取物溶液；一定浓度的X药液；生理盐水；小鼠白细胞介素IL-23 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（ADL 公司）；雾化器（德国PARI公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司）；RT-PCR检测仪器；组织抗修复液；SP试剂盒、DAB显色试剂盒。模型III：一定浓度的X药液；生理盐水；小鼠白细胞介素IL-23 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（ADL 公司）；雾化器（德国PARI公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司）；RT-PCR检测仪器；组织抗修复液；SP试剂盒、DAB显色试剂盒。1.1.3 方法1.
12、1.3.1 动物分组与造模： 模型I: 将30只小鼠实验前饲养1周后随机分为3组，每组10只。哮喘给药组：清洁级环境，普通饲料。第10天和第20天小鼠腹腔注射致敏液（0.08%，OVA）0.25ml/10g。第30天50天小鼠于密闭容器中以1%的OVA溶液雾化吸入30min，第3040天每日雾化，第4050天隔日雾化，第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。哮喘非给药组：清洁级环境，普通饲料。OVA致敏液处理同哮喘给药组，但第60天则以生理盐水雾化吸入10min。对照组：清洁级，普通饲料，生理盐水致敏激发，于第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。模型II: 将30只小鼠实验前饲养1周
13、后随机分为3组，每组10只。哮喘给药组：清洁级环境，普通饲料。第10天和第20天小鼠皮下注射致敏液（0.08%，橄榄花粉提取物）0.25ml/10g。第30天50天小鼠于密闭容器中以1%的橄榄花粉提取物溶液雾化吸入30min，第3040天每日雾化，第4050天隔日雾化，第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。哮喘非给药组：清洁级环境，普通饲料。橄榄花粉提取物致敏液处理同哮喘给药组，但第60天则以生理盐水雾化吸入10min。对照组：清洁级，普通饲料，生理盐水致敏激发，于第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。模型III：将20只小鼠实验前饲养1周后随机分为2组，每组10只。哮喘给药组：清
14、洁级环境，普通饲料。第10天和第20天小鼠皮下生理盐水，0.25ml/10g。第30天50天小鼠于密闭容器中以生理盐水雾化吸入30min，第3040天每日雾化，第4050天隔日雾化，第60天以1%的X药溶液雾化吸入10min。哮喘非给药组（对照组）：清洁级环境，普通饲料。生理盐水处理同哮喘给药组，但第60天则以生理盐水雾化吸入10min。1.1.3.2 采集标本 于末次激发后48h内，小鼠10%水合氯醛麻醉后称重，仰卧位固定小鼠，分离颈部组织，暴露气管，打开胸腔，分离肺脏，结扎右侧肺门后取右肺。气管插管以PBS液缓慢反复灌洗左肺，回收率80%以上，重复灌洗3次，收集BALF 1ml置于EP管中
15、。右肺上叶置于10%中性福尔马林液中固定，右肺下叶至于冰块上保持待用。1.1.3.3 小鼠哮喘发作表现 OVA激发时，观察哮喘非给药组小鼠，应出现明显头面部瘙痒、烦躁不安、呼吸急促、弓背直立、前肢缩抬等哮喘急性发作表现；哮喘给药组小鼠应没有哮喘剂型发作的表现或表现不明显。对照组小鼠应观察记录其出现的特别反应，从而为X药的不良反应提供体外动物实验依据。实验结束前3组小鼠应均无死亡。1.1.3.4 肺组织匀浆IL-23含量测定 取右下肺组织研磨后匀浆离心取上清液0.1ml，用ELISA法测定IL-23的含量。1.1.3.5 病理检查 右肺上叶于福尔马林固定液中固定48h后进行石蜡包埋切片，所得石蜡
16、切片进行HE染色。观察组织形态、气道上皮损伤情况，气管及血管周围炎性细胞浸润情况。1.1.3.6 RT-PCR检测肺组织中IL-23mRNA表达 提取肺组织总mRNA进行RT-PCR反应，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统分别测定各扩增条带的吸光度值。将目的条带与内参GAPDH 带的比值作为其mRNA 水平的指标。1.1.3.7 免疫组化法检测肺组织中IL-23表达（方法略） 最后检测标准为：在高倍视野下，细胞胞浆和( 或) 细胞膜呈棕黄色着染为阳性细胞，计数10个视野下阳性细胞数，取平均值作为测定结果。（注明：模型I和II小鼠模型建立采用不同的致敏原，模型III为自发性动物模型，上述实验现象观察
