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1、微生物制药,一、微生物药物的几个相关基本概念 二、微生物药物的分类 三、微生物药物的应用 四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 五、微生物药物的发酵生产技术 六、微生物药物的分离、精制和鉴别 七、废弃物的综合利用和环境保护,四、药源微生物及微生物 药物的筛选技术（2）,（一）药物的产生菌 （二）新药产生菌的分离 （三）新微生物药物的筛选 （四）微生物药物产生菌的菌种改良 （五）微生物药物产生菌的保藏,（二）新药产生菌的分离,1、土壤微生物的分离,土壤是微生物的重要栖息地。,（1）采集样品 （2）分离微生物 （3）选留菌种及保存,分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥和水、枯树叶、堆肥、
2、动物粪便等。 土壤样品通常采表层土（5cm以下），样品以未开垦过的土壤为佳，要尽可能选择不同地理和生态环境的土壤。,1、土壤微生物的分离,（1）采集样品 （2）分离微生物 （3）选留菌种及保存,样品的处理 分离培养基 抑制剂的使用 分离方法 培养条件 稀有放线菌的选择性分离 其他微生物的分离,利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线菌孢子间的耐性差异，用物理或化学的方法除去细菌及目的外放线菌，或者用花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分出率。,样品的处理,A）温度,B）化学试剂的处理,SDS-酵母膏处理法，SDS对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌数明
3、显减少。 风干的土壤与CaCO3混合后在26培养79 d，然后分离放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，CaCO3有利于放线菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。,用0.01 mol/L NaOH处理土壤510 min（15）可减少细菌的数量，有利于分离小单孢菌。 用1.4%酚处理土样10 min或用1.4%酚130处理30 min，分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。 用乙酸乙酯或氯仿和苯处理样品，过滤风干后用来分离微生物，可以除去样品中的真菌。,B）化学试剂的处理,C）物理方法的处理,离心，1600 g离心20 min，上清液主要有放线菌孢子，沉淀含有细菌和真菌孢子。 超声波处理，分离小单孢菌和链霉
4、菌。 特殊器具捕集空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。 搅动，使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。 膜过滤，将水经膜（孔径0.45滤膜）过滤，浓缩水中微生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。 诱饵法，在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发等，可分离小瓶菌和发仙菌。,分离培养基,合成培养基精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天门冬素培养基，察氏培养基等 有机培养基Waksman培养基，Bennett培养基 几丁质培养基只有放线菌能够利用几丁质，生长的菌落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区分 HV培养基以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基,总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都
5、生长出来，而其他微生物（细菌和真菌）尽可能不长。,抑制剂的使用,加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rose bengal等），抑制真菌生长； 加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌的分出率； 加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。,分离方法,稀释法 干土喷射法 孢子飞扬法 滤膜法,最常用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。,用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直接喷在分离平板上。,将0.220.45m的滤膜放在分离平板上，接种
6、菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入培养基的放线菌经继续培养后长出菌落。,将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置一个分离平板，剧烈振荡使孢子飞扬，撞到分离平板上进行分离培养。,培养条件,一般培养温度为2530，也有3237，培养714 d，生长慢的放线菌可延长培养1个月； 分离高温放线菌用4550培养12 d； 海水放线菌用20培养6周左右。,稀有放线菌的选择性分离,稀有放线菌的特征： 生长速度比较缓慢； 营养需求较为复杂； 比较缺乏孢子分化的能力； 不能稳定保存。,其他微生物的分离,1、土壤微生物的分离,（1）采集样
7、品 （2）分离微生物 （3）选留菌种及保存,将菌株的优良特性保存下来，保持微生物的活力。,低温保藏法 传代培养保藏法 液体石蜡保藏法 沙土保藏法 冷冻干燥保藏法,2、海洋微生物的分离,分离海洋放线菌的培养基： （1）SC培养基： （2）Z培养基： （3）普通分离放线菌培养基适当稀释，再加入人造海水,3、极端微生物的分离,极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高碱、高压等）中形成的一类特殊的微生物，因而在分离这类微生物时，需考虑它们生长繁殖所需的特殊条件，以设计分离与培养条件。,分离嗜热微生物，有些菌株的最适生长温度高达80，pH在16； 分离嗜盐微生物时培养基中的盐浓度可高达2.5 mo
8、l/L。,4、其他微生物资源,粘细菌,基因重组微生物 利用基因工程技术构建产生新的次级代谢产物的基因重组微生物，逐步创立组合生物合成。 利用基因重组微生物提高已有抗生素的产量和有效组分的含量。,纤维素堆囊菌（Sorangium cellulosum）大环内酯类抗生素堆囊菌素， 琥苍菌素（抗真菌）,组合生物合成将产生不同抗菌药物或其他生理活性中间体的基因重组到一种微生物中，使其生物合成途径重新组合，生产迄今自然界还没有的新的抗生素或生理活性化合物。,5、难培养微生物的分离与培养研究,VBNC（viable but nonculturable）指那些可培养的不分化的微生物在受到外界压力刺激后，通过一系列的类似分化的遗传程序而使自身处于一种能抵抗饥饿和压力的状态；尽管此后不能用常规的培养方法恢复其生长繁殖，但实验证明它们仍保持生存力与致病因子和/或基因。,
