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1、Wnt/-catenin信号 转导途径,Wnt信号通路,人类Wnt基因家族由19个成员组成，编码具有22或24个半胱氨酸残基的保守糖蛋白。 Wnt信号转导途径可以分为决定细胞命运的经典途径和控制细胞运动及组织极性的非经典途径。,Wnt途径的发现,Wnt基因于1982年发现，最初是作为小鼠乳腺肿瘤病毒优先整合的位点而被鉴定的，该基因能在细胞间传递增殖和分化信息，是一种癌基因，当时被命名为Int基因(小鼠Int-1和Int-3)。随后发现它与果蝇的无翅基因(wingless)属直相同源基因(orthologous gene)，从而将二者结合命名为Wnt基因。随着研究的不断深入人们发现Wnt基因家族
2、非常庞大，为多基因家族，其基因结构从低等的无脊椎动物到脊椎动物乃至人类具有高度保守性，其同源序列达27-83%，对动物的生长发育起着至关重要的作用。Wnt基因编码的WNT蛋白，可启动细胞内信号传导途径，传导生长刺激信号，参与不同的发育机制，如细胞分化，移行，以及决定细胞命运的增殖等。因其启动蛋白为WNT蛋白，故命名为Wnt信号途径。,1996年，Wnt途径的主要成员被相继确定和克隆。研究发现，这一信号途径主要包括三个环节，即由Wnt配体与胞膜受体的特异性结合，引发胞内一系列级联反应，进而调节核内的基因表达。传统的信号途径系统观点认为，信号是从细胞表面到细胞核的线性传递。Wnt信号途径的起点为胞
3、膜，由分泌性信号蛋白Wnt，通过跨膜的受体蛋白，经由多种细胞内蛋白将信号传至细胞核内。这点上看，它是一种与传统观点相一致的信号途径系统。然而许多研究发现，Wnt途径和其他细胞功能、信号传递过程相互交叉，不是直线型的结构，而是一个网络调节模式，具有几个关键调控点。,Wnt途径总的框架,1.Wnt/-cantenin途径，即典型的Wnt/-cantenin信号途径(canonical Wnt/-cantenin pathway)。该途径通过-cantenin的核易位，激活靶基因的转录活性。 2.平面的细胞极性途径(planar cell polarity pathway)， 涉及RhoA和Jun
4、N端激酶以及细胞骨架的重排。目前还没有实验资料证明该途径参与肿瘤的发展。 3.Wnt/ca2+途径，由Wnt5a和Wnt11激活，增加胞内Ca2+含量，激活蛋白酶C、磷脂酶C和转录因子NF-AT。Wnt/Ca2+途径可以和典型的Wnt/-cantenin信号途径相互作用，但是该途径在肿瘤发生中是否起作用尚不清楚。,Wnt信号途径,Wnt途径的组成和实现,研究Wnt途径的组成，主要运用基因和分子生物学相结合的手段加以分析与认定，Wnt途径候选分子的确定标准为：该分子失去功能显性，则Wnt信号途径的功能即消失，而该分子获得功能时，Wnt信号途径也同时具有功能。经过十多年的研究，目前认为Wnt途径的
5、主要组成为：Wnt信号蛋白，胞膜受体FZD家族，胞浆内-catenin、Dsh、APC、GSK3等蛋白分子,细胞核内LEF/TCF转录因子家族等。,胞内信号传递,Wnt信号进入胞内后，将信号传递给Dishevelled(Dsh)，活化的Dsh抑制由Axin、APC (adenomatous polyposis coli)和GSK-3(serin/threonine glycogen synthasekinase 3)组成的复合物的活性,使-catenin不能被GSK-3磷酸化。磷酸化的-catenin才可通过遍在蛋白化(ubiquitination)而被胞浆内的蛋白酶体所降解，由于非磷酸化的-
6、catenin不能被蛋白酶体降解，从而导致-catenin在胞浆内积聚，并移向核内。当游离的-catenin进入细胞核内，即可与转录因子TCF/LEF(T-cellfactor/Lymphoid enhancer factor)结合，激活TCF转录活性，调节靶基因的表达。因此,-catenin是否磷酸化是该信号传递的关键因素。,靶基因,目前已经研究鉴定出多种Wnt途径的靶基因，它们在细胞增殖、分化以及肿瘤形成中起重要作用。主要包括：细胞周期和凋亡相关基因c-myc和cyclinD1,生长因子如VEGF(vascular endothelial growth factor),胃泌素(gastri
7、n)、HGF(hepatocyte growth factor)、c-met等。参与肿瘤进展的基因MMP7(matrilysin)、MMP26、CD44和Nr-CAM,转录因子ITF-2(immunoglobulin transcription factor-2)和Id2,其他靶基因如COX-2等.由于这些因子在细胞增殖、分化以及肿瘤发生发展中分别体现不同的特点，因此Wnt信号传递是一种由多因子组成、涉及多个环节、多种调控的复杂过程。,在正常生长的成熟机体中，细胞的生长、增殖和分化等具有一定的规律性和有序性。有限生长的细胞在没有Wnt信号时，Wnt通路呈关闭状态。但当Wnt途径激活时，就可能导
8、致许多细胞出现灾难性的变化，使细胞发生异常的增生和分化，导致肿瘤形成。,Wnt途径异常激活主要见于： 1）组成Wnt途径的蛋白、转录因子或基因被破坏或变异，导致该途径关闭或局部途径异常活跃； 2）过多Wnt信号使整个途径异常活跃，细胞进行不必要的增殖； 3）细胞内其他因素通过Wnt途径来刺激或诱发细胞产生异常反应。,在Wnt途径中,-catenin-TCF/LEF复合体无疑是Wnt途径的枢纽。如前所述，Wnt途径激活是以-catenin定位变化-易位为基础，一旦-catenin易位于细胞核内，与TCF/LEF结合，即可启动Wnt途径。因此，Wnt途径的调控可分为两部分：上游各组分结构和功能变化
9、导致-catenin降解障碍，引起-catenin胞浆内积聚；核内-catenin激活TCF/LEF引起下游靶基因转录，通过推动细胞周期发展或产生异常蛋白，使细胞发生癌变。,-catenin是第一个被确定为Wnt途径的成员。在细胞内,-catenin具有二个定位池：一个是位于细胞膜,与E-cadherin和-catenin形成粘附复合体，参与细胞黏附；另一个则在胞浆。-catenin基因定位于3p21，由16个外显子组成，其中外显子3的第37，33，41，45位密码子编码区域构成-catenin蛋白的NH2末端，是GSK3的结合部位，也是致癌活化的位点，该区域的定向突变或缺失可导致-caten
10、in活性过高，致使GSK3对-catenin降解受阻，-catenin在胞浆内积聚。Clements对311例胃癌标本进行-catenin的检测，发现29%病例存在-catenin核内易位，19%存在3号外显子突变。,研究发现，许多肿瘤中存在着不同程度的-catenin基因突变。如结直肠癌、肝细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌和皮肤癌,-catenin突变率可达50以上，前列腺癌、子宫内膜癌和Wilms瘤等为15左右，胃癌为26。突变位点多集中在外显子3区域，特别是GSK3的结合部位。-catenin的定位改变，除了受其本身基因突变的影响外，Wnt途径上游各组分形态和功能的变化也可影响-catenin的
11、状态。主要包括Wnt,APC,GSK-3和Axin。,APC(adenomatous polyposis coli)是一种与结肠癌发生有关的抑癌基因。定位于5q21，长度10.4kb，编码一组较大的多结构域蛋白，属于胞浆蛋白，具有支架蛋白的作用。APC蛋白、Axin和GSK3,可与-catenin形成复合物，而促进-catenin发生磷酸化，使-catenin得以被蛋白酶降解。在固有的和散在的大多数结直肠肿瘤中，均已发现有APC基因的突变或缺失。APC基因突变可发生于任何外显子，其中以第15外显子（654-2843密码子）最为常见2000，1020-1169密码子和1323-2075密码子编码
12、区域被认为是-catenin与APC的结合位点，该区域突变即导致-catenin不能与APC结合，进而不能被GSK3磷酸化，以致-catenin降解受阻而积聚于胞浆。因而APC是Wnt途径的负调控因子。在其他癌症如髓母细胞瘤，侵袭性纤维瘤病，乳腺癌等也可见APC异常。,Axin具有多个蛋白-蛋白作用域，与APC一样起支架蛋白的作用，是支架蛋白复合体的构建基础。Axin的RGS功能域(regulators of G protein signaling domain)，能与全长的APC结合，但不能与截短的无活性APC结合。APC-Axin-GSK-catenin形成复合物时，GSK靠近-caten
13、in而促使其磷酸化，因此也是Wnt途径的负调控因子。在肝癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤中检测到Axin基因突变，目前Axin被认为是抑癌分子，其基因突变可促进肿瘤的发生。,GSK(serin/threonine glycogen synthase kinase 3)可使-catenin磷酸化，磷酸化位点为-catenin的4个N端位点（s33,s37,T4,s45），这些磷酸氨基作为-catenin磷酸化的一种标志，表明它将被蛋白酶体通过水解而降解。GSK3是Wnt途径的负调控因子，同时也是候选抑癌分子。在Wnt信号通路发生异常时是否存在GSK3的突变问题尚少探讨，但已有在结肠癌中没有检测到GSK
14、3突变的报道，GSK3是否具有其他功能，以及可能在其他途径中发挥重要的作用还有待研究。,DSH(Dishevelled)是Wnt途径正调控因子，其N端的DIX域，可结合Axin，中央区的PDZ域，为蛋白-蛋白相互作用的位点，可结合多种蛋白质，如CKI-,CBP/Frat,酪蛋白激酶等，而其C端DEP域则具有调节细胞的极性及移动的作用。,Wnt分泌蛋白及其受体FZD在肿瘤中也可出现异常表达。在结肠癌、胃癌中，可见Wnt2、Wnt5A、FZD1/2表达明显高于正常粘膜组织。但Wnt基因的突变和错义表达与人类肿瘤的直接联系迄今尚待阐明。To等对12例胃癌标本（7例为肠型，4例弥散型，1例混合型）检测
15、Wnt受体FzE3及其相关蛋白hsFRP的变化情况，研究发现，75病例存在FzE3表达上调，同时也观察到-catenin，hsFRP和cyclinD异常表达。在胃癌细胞株的研究中发现，FZD2，FZD5，FZD7，FZD8，FZD9在不同的细胞株异常表达；Wnt家族的多个成员在另外一些细胞株也检测出有的情况高表达。,TCF是Wnt途径下游组分，属于DNA结合蛋白，包括1个HMG盒子(highmobility group)和-catenin作用域。HMG盒子具有与DNA结合的活性，通过与其它因子发生作用，而激活转录活性。有趣的是，TCF转录因子家族的不同成员具有不同的特性。尽管它们都可结合DNA
16、，但在大部分情况下并不能激活转录，只有与-catenin发生作用后，才可激活转录过程。有报道在结直肠癌中，检测出Tcf-4突变，且同时存在APC或-catenin的突变，推测Tcf-4突变可能是附加突变。,Wnt途径激活与肿瘤细胞的侵袭和转移,癌细胞最为重要的生物学特征是具有侵袭和转移的能力，这是造成恶性肿瘤患者预后不佳和导致死亡的主要原因。癌细胞的侵袭和转移包括以下几个过程：癌细胞粘附性改变，从原发灶脱落，突破基底膜，与细胞外基质作用，侵入周围基质和邻近组织，然后侵入淋巴管或血管，随血流或淋巴，在远部器官或组织建立新的癌细胞集落。在此过程中，涉及到细胞粘附性的改变，细胞外基质的降解，细胞增殖的改变及肿瘤血管形成等。随着对Wnt途径研究的深入，发现Wnt途径异常激活后，其靶基因中有些是与癌细胞的侵袭转移相关的基因，因而推测Wnt途径也可参与肿瘤的侵袭和转移。,细胞间粘附的破坏可促进癌细胞的迁移和浸润，导致侵袭和转移。-catenin在细胞中起着双重作用：除了参与
