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1、第九章 血清学反应,12/14/2018,2,一 血清学反应的概念及一般特点 抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体主要存在于血清中，故称为血清学反应。 血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般特点是：,第一节 概 述,12/14/2018,3,（一）特异性和交叉性 血清学反应具有高度特异性。抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。 生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原成分，在进化过程中形成不同的种类，有各不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。,12/14/2
2、018,4,（二）结合的可逆性 抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合受理化因素的影响，当温度超过60C或pH降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免疫活性保留。,12/14/2018,5,（三）最适比与带现象 抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。 如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之区带现象或带现象。为了避免血清学反应的带现象，需要将抗原或抗体作适当的稀释。,12/14/2018,6,12/14/2018,7,比例不适
3、合不能完成第二步反应 带现象,12/14/2018,8,（四）反应的阶段性 抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段： 第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见反应； 第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较慢，需几分钟或更久。第二阶段受电解质、温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中无严格界限。,12/14/2018,9,（五）影响反应的因素 1.电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时，一般用生理盐水或8%10%高渗盐水作稀释，才出现较强反应。,12/14/2018,10,2.温度
4、 温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触，加速反应的出现，故通常将抗原抗体混合后，放置37C温箱或水浴箱中，保持一定时间，促进反应。温度高，加速反应；温度低，反应时间延长，但反应结合充分，故在补体结合反应、免疫吸附实验中，采用低温放置过夜。,12/14/2018,11,3.酸碱度 血清学反应通常用pH68，过酸或过碱都可使复合物离群，pH值在等电点时，可引起非特异凝集。,12/14/2018,12,二 血清学反应的类型 沉淀、凝集、琼脂扩散、中和、补体结合和免疫吸附试验等。,12/14/2018,13,三 血清学反应的应用方式和目的 抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须有一个是已知的，通
5、过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一病原微生物时，多用已知抗体。诊断传染病时，对慢性病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体；诊断急性病则用已知的抗体检测未知的抗原（病原），如炭疽病等。,12/14/2018,14,（一）抗原与抗体的快速检测 在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学方法检查抗体或抗原（细菌、病毒）的存在，作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记抗体技术，均能快速、简便的确诊抗原或抗体。,12/14/2018,15,（二）生物活性物质的超微定量 应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术，抗原抗体检测的敏感度均大为提高，已达到能精确测
6、出Pg的水平，其敏感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产物。,12/14/2018,16,（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位 用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察，可以测定病毒在亚细胞水平的定位，也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。,12/14/2018,17,（四）微生物的鉴定与分析 应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等血清学实验，进行微生物的鉴定及区别微生物的血清型，从而确
7、定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微生物的抗原组分进行分析。,12/14/2018,18,（五）血型鉴定 用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验等技术，可作血型鉴定、亲子关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。,12/14/2018,19,第二节 沉淀试验,可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试验（Precipitationreaction test）。 可溶性抗原 +免疫血清 出现沉淀现象 (血清蛋白、病毒) （抗体） 比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 不出现沉淀现象,0.85%NaCl,12/14/
8、2018,20,一 液相沉淀试验 1环状沉淀试验 原理：试管内，下层沉淀素与上层 沉淀原在液界面应形成白色沉淀环。 用途：检测皮毛中的炭疽 杆菌抗原（Ascoli试验） 2絮状沉淀试验 抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素测定。,12/14/2018,21,二 琼脂扩散试验,琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗粒
9、的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原或抗体中一种成分扩散）和双扩散。 根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。,12/14/2018,22,1 单向单扩散,将0.6%-1%琼脂加热熔化后，加入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入小试管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立，置于37C中，2-3h后出现沉淀线。由于抗原的扩散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。,12/14/2018,23,2 单向双扩散 基本作法同上，但在
10、抗原与抗体之间加一层不含抗体的盐水琼脂，抗原与抗体均向中间琼脂扩散，形成沉淀带。主要用于抗原成分的分析。,12/14/2018,24,3 双向单扩散 亦称辐射扩散。在平皿或玻板上进行。用2%缓冲琼脂盐水，加热融化，待冷后加入经预热的抗血清（用1：5-10倍稀释），混合后倒入平皿或玻板上，厚2-3mm。凝固后在凝胶板上打孔，孔径2-3mm，孔内滴加抗原液，放置湿盒中37C下扩散。抗原在孔内向四周扩散，与凝胶中的抗体接触，形成白色沉淀环，白环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质定量实验。,12/14/2018,25,4双向琼脂扩散（琼扩） 此法系采用1%琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝
11、胶板，可按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在37C湿箱中24-72h后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每一种抗原成分出现一条沉淀带。,12/14/2018,26,结果判断： 如两个相邻孔之间抗原相同，则沉淀带融合；抗原则不同，则互相交叉；部分相同则部分融合，另外不同部分则交叉。,12/14/2018,27,特点：简便、敏感性低、耗时、应用最广 用途：常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。,12/14/2018,28,第三节 凝集试验,细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮片状团块，
12、这种试验称为凝集试验（Agglutiation test）。 参与反应的抗原叫凝集原；参与反应的抗体称为凝集素，主要有IgG、IgM。凝集实验有直接凝集试验和间接凝集试验两种。,12/14/2018,29,基本原理： 生理盐水 颗粒性抗原 + 相应抗血清 颗粒凝集 (细菌、红细胞) 比例适合 凝集原 凝集素 多 后带现象 （稀释血清）,12/14/2018,30,一、直接凝集试验 颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。按其操作方法可分为玻片发和试管法。,12/14/2018,31,1玻片凝集试验 将已知的抗血清1-2滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液（抗原
13、）加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或絮片状凝集，谓之阳性反应。 特点：简单、快速 用途：定性，细菌鉴定、血型鉴定。如用已知的沙门氏菌血清，鉴定沙门氏杆菌的抗原组分以定型。此法也用于畜禽传染病诊断，如用已知的鸡白痢有色平板抗原，检查鸡血清中有无相应抗体，进行鸡白痢检疫,12/14/2018,32,2试管凝集试验,是一种定性与定量相结合的方法。试验时用一列试管，将待检血清用0.5%石炭酸生理盐水作10倍递进稀释，每管维持量为0.5ml，一管不加血清作对照。每管中加入一定浓度的抗原0.5ml，混合均匀，在37C或室温下静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不同的凝集程度记录为+（100%菌体
14、凝集），+（75%凝集），+（25%凝集）。,12/14/2018,33,凡能与一定量抗原发生50%凝集（+）的血清最高稀释度，为血清的凝集价或效价（滴度）。在试验时，必须建立阴性、阳性血清对照管。 特点：准确、耗时 用途：诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价(定量),12/14/2018,34,二、间接凝集试验 基本原理： 可溶性抗原+惰性载体（聚苯乙烯乳胶微粒、炭粒、绵羊红细胞等） 抗原致敏载体 抗原致敏载体+相应免疫血清(抗体) 电解质 被动载体凝集(间接乳胶凝集、间接炭素凝集、间接红细胞凝集等 ),12/14/2018,35,特点：敏感(在微量反应板中进行试验)、快速。 用途：用已知抗原致
15、敏的载体可检测血清中的特异抗体及其效价。 若用已知免疫血清（Ab）致敏的红细胞，则可检测病毒等可溶性抗原称为反向间接血凝试验。,12/14/2018,36,12/14/2018,37,（正向）间接凝集反应原理示意图,12/14/2018,38,（反向）间接凝集反应原理示意图,12/14/2018,39,间接凝集抑制反应原理示意图 A：标本中含抗原 B：标本中不含抗原,12/14/2018,40,第四节 与补体有关的试验,一、补体的性质 补体是存在于正常动物血清中的一组蛋白质。 补体没有特异性，它能与任何抗原抗体复合物相结合，但不能与游离的抗原或抗体相结合。 补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现
16、溶血反应、溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏膜试验等。由于补体具有这一特性，故常用其来检验抗原或抗体是否发生特异性结合，特异性抗原或抗体是否存在。,12/14/2018,41,二、溶解试验 1.溶血试验 红细胞与相应的抗体（溶血素）相结合后，在补体的参与下，可发生溶血反应（直接溶血反应），以作补体结合反应的指示系统。 吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存在下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶血反应。间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而新鲜红细胞不易保存，限制了本法的应用。,12/14/2018,42,2.溶菌试验 某些细菌（如霍乱弧菌）与抗体结合后，如有补体存在，可发生细菌溶解或被杀死，这种反应称为溶菌反应或杀菌反应。,12/14/2018,43,三补体参与的试验补体结合试验 补体结合试验是应用可溶性抗原与相应抗体结合,其抗原抗体复合物可以结合补体,但这一反应肉眼看不到,如再加入致敏红细胞,即可根据是否出现溶血反应判断反应系统中是否存
