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1、1,抗肿瘤新药的主要 药效学和毒理学研究,李 波 中国药品生物制品检定所 国家药物安全评价监测中心,2,新药的开发过程,$600 millions 6 to 12 Years,Drug Discovery,Non-Clinical Development,Clinical Trials,Phase III,Phase II,Phase I,Market Launch,CS,FHD,PD,Submission,am,Toxicology/ADME,3,抗肿瘤药物分类,(1)细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等 (2) 生
2、物反应调节剂(biological response modifier) (3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent) (4) 肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer) (5) 肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor) (6) 分化诱导剂(differentiation inducing agent) (7)生长因子抑制剂(growth factor inhibitor) (8)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide),4,抗肿瘤药物药效学,包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验
3、评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。,5,体外抗肿瘤活性试验,试验目的 对候选化合物进行初步筛选 了解候选化合物的抗瘤谱 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等,6,试验方法,选用10-15株人癌细胞株 根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养 推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。 试
4、验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。,7,测定细胞生长和存活方法,MTT法和XTT法是代谢测定法，没有颜色的tetrazolium salt (MTT 和XTT)被细胞还原，产生具有颜色的与活细胞数成比例的formazan， 比色测定。 为了简化MTT solubilization步骤，发展了XTT tetrazolium测定方法，MTT还原产生不溶性formazan ,比色测定前溶解于DMSO，XTT试剂可被活细胞直接代谢成水溶性formazan，不需进一步处理培养细胞，便可以立即读取光密度。方便简单，其缺点是可产生相对比较高的背景数据，同时也具有M
5、TT的不稳定终点特性。,8,测定细胞生长和存活方法,对系列蛋白质染色剂进行实验，发现磺酰罗丹明B （sulforhodamine B）(SRB)可替代tetrazolium assay方法， 具有最好的燃料结合强度，信噪比率，并且和细胞数具有很好的线形关系，SRB是一亮粉色染料，在稀醋酸中，可结合于TCA固定细胞的碱性氨基酸上。具有十分稳定的终点 。,9,评价标准,以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线 采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。 体外试验至少重复一次。,10,体内抗肿瘤试验,体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型 动物肿瘤移植模型 人类肿瘤
6、裸鼠移植瘤模型 重复试验 鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型、原位接种模型和中空纤维测定(hollow-fiber assay)等 方法。,11,动物,动物要求健康，符合等级动物要求，有实验动物合格证。 雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同。 小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克。 评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠。,12,肿瘤模型,小鼠肿瘤模型 淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、
7、肉瘤-180等，以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株等。,13,肿瘤模型,人类肿瘤裸鼠移植模型 应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人类肿瘤裸鼠移植试验。,14,缺点 部分模型很难构建， 皮下抑制肿瘤很少转移，生存时间不适合作为试验终点,优点 可预测细胞毒类化合物的活性 有助于筛选化合物，为临床用药程序和联合用药方案提供参考 可用于研究获得性药物抗性,人癌移植模型,15,人癌移植模型,NCI回顾性研究： 多个人癌移植模型试验的阳性结果可在一定程度上提示临床有效性 非小细胞肺癌移植模型具有临床相关性,通常移植临床拟治疗的肿瘤细胞,16,人类肿瘤裸鼠移植模型建立时的注意点,移植瘤一般由相应的细胞株移植而建
8、立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。 移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。 对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于 15-20代,17,人类肿瘤裸鼠移植模型建立时的注意点,细胞要求达到最低质量保证标准（支原体、MAP、人类同功酶、核型和体内致瘤性的检查）、适应同一培养液以及具有可重复的生长和药物敏感特性。制备大量的保种细胞，并冷冻保存，用于药物筛选过程中细胞经20代传代后的替换。所有细胞在筛选过程中均要进行详细特性确认，如组织病理、超微结构、免疫细胞化学，以确定和证明组织和肿瘤类型。,18,肿瘤模型产
9、生免疫原性的表现,近交系动物的遗传特性发生漂移，对肿瘤模型产生免疫性。 产生免疫性的表现有： 1.在传代和对照组中出现肿瘤消退，假如肿瘤出现溃疡、消退和再生长，可能是感染造成，如果是溃疡、消退，并且不再生长，通常是由于免疫原性引起。如果用60mg的同种肿瘤攻击动物，结果没有生长，基本可以肯定产生了免疫性。,19,肿瘤模型产生免疫原性的表现,2.在化疗实验中有大于2个剂量水平的治愈时，应怀疑有免疫原性在起作用。 3.在生命延长期实验中，存活动物的生命延长增长百分率应小于250%，如果大于250%应怀疑有免疫原性在起作用。 4.缺乏明显的侵袭性和转移，可能是由于肿瘤的恶性程度比较低，也可能是由于免
10、疫性问题造成。,20,肿瘤模型产生免疫原性的表现,5.对药物反应性的改变表明免疫原性的形成。 6.肿瘤在后期阶段比早期阶段的反应更好，肯定表明是免疫性参与，对于均质性的肿瘤模型而言，开始给药的时间越早，肿瘤反应越好，免疫反应要经对抗原的识别和处理后才能产生。 给予小鼠两次用X-射线杀死的肿瘤细胞，间隔10天，再10天后，给处理和没有处理的小鼠移植活的肿瘤细胞，检测免疫性的产生是一种很好方法，费时、费力。,21,试验过程,肿瘤接种方法 皮下接种 腹腔接种 原位接种,22,皮下肿瘤模型,选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物
11、皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。将瘤组织剪成1.5 mm3左右，用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为（1-5）106。,23,腹水瘤模型,无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水，以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数量一般为（1-5）106。,24,原位接种模型,原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励使用的方法。主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法,25,实验设计,试验设阴性对照组、阳性对照组、治疗组
12、。 治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100300mm3后将动物随机分组。 动物数普通小鼠每组10只，裸鼠6只。,26,剂量设置,治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置，高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量。 阴性对照组给予相应的溶剂； 阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物， 如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳性对照药。,27,阳性对照药选择原则,疗效确切 与被试物质化学结构类似 与被试物质有类似的作用机理。,28,药物配制,溶于水的药物，用生理盐水或蒸
13、馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5N HCl)或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，调节pH在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或用吐温60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射。,29,给药方案和给药途径,分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。 给药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时
14、要注意这两种给药途径是有差别的。 可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。 腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。,30,评价标准,腹水瘤模型 接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数。如阴性对照组20%动物存活时间超过4周，表明腹水瘤生长不良，实验作废。,31,评价标准,裸鼠移植瘤模型 推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物抗肿瘤的效应。 肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2-3次,每次测量同时还需称鼠重。,32,评价标准,肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V = 1/2ab2 或/6abc 其中a、b、c分别表示长宽高。两公式的相关性极好，可
15、采用任一公式。 根据测量结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV）， RTV = Vt / V0。 其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。,33,评价标准,抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%） TRTV T/C % = 100% CRTV TRTV：治疗组RTV ；CRTV：阴性对照组RTV。 疗效评价标准：T/C % 60 %为无效；T/C % 60（42？）%，并经统计学处理P0.05为有效。,34,评价标准（小鼠肿瘤模型）,生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤径的评价方法。 生长较快小鼠肿瘤可采用
16、称瘤重的方法评价。试验结束后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克，或20%肿瘤重量小于400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。,35,评价标准（小鼠肿瘤模型）,疗效评价公式： 给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重 肿瘤生长抑制率 = 100% 阴性对照组平均瘤重 评价标准 肿瘤生长抑制率40%为无效；肿瘤生长抑制率40%，并经统计学处理P0.05为有效,36,评价标准（原位接种模型）,不同原位接种模型可采用不同评价方法， 主要有瘤重和生存时间评价法。如肝原位接种可用瘤重评价，颅内接种可用生存时间评价。评价方法、标准和注意事项同腹水瘤模型和小鼠肿瘤模型。,37,抗肿瘤药物的特殊要求,I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制的初步研究。 非细胞毒类药物除完成体内外抗肿瘤试验，还应进行特定抗肿瘤作用研究。,38,生物反应调节剂,药效学包括 ：体内抗癌试验和免疫功能研究。 体内抗癌试验注意点： 模型：裸鼠是免疫缺陷动物，一般应用正
